ინფორმაცია

რომელია საუკეთესო გზა ფონზე სიგნალის ამოღებისაგან ბენდიდან, როდესაც აკეთებთ Western blot გამოსახულების ანალიზს?


მე ვაკეთებ ვესტერნ ბლოტის სურათის ანალიზს J. მე გავამრავლე ფართობი საშუალო ინტენსივობით მთლიანი ინტენსივობის მისაღებად. თუმცა, მე მინდა ამოვიღო ფონის სიგნალი თითოეული ცილის ინტერესიდან.

ფონის მორგებული ცილის სიგნალი გამოითვლება შემდეგნაირად: (ცილის საშუალო ინტენსივობა - ფონის საშუალო ინტენსივობა) * (ცილის ზოლის არე)რა ჩემს ლაქაზე მე მაქვს ჩემი ცილის ორი იზოფორმი, რომელიც გამოვლენილია ანტისხეულების მიერ და მინდა გამოვიკლო ფონი ყველა ზოლიდან ორივე ცილისთვის.

ისე, როგორც მე ვიანგარიშებ ფონს, არის თითოეული ზოლისთვის, რომელიც მართკუთხა შერჩევას აკეთებს შესახვევის ზედა ნაწილში, სადაც არ არის მარკირება ცილის საწინააღმდეგოდ. მართკუთხა მონაკვეთის სიგრძე უდრის ბილიკის სიგრძეს. თუმცა არ ვარ დარწმუნებული, რამდენად ფართო უნდა იყოს ფონის მართკუთხედი. რაც მე ვნახე ინტერნეტში, არ არსებობს ფონის სიგნალის გამოთვლის ფიქსირებული მეთოდი.

არსებობს რაიმე გზა იმის დასადგენად, თუ რამდენად ფართო გსურთ თქვენი ჯგუფი იყოს თქვენი ფონზე? Მაგალითად. უნდა იყოს თუ არა ზოლის სიგანე ფონისთვის ცილის ინტერესის სიგანის, ან შეიძლება იყოს ამაზე ფართო?

გარდა ამისა, როგორ შეგიძლიათ იცოდეთ, თუ თქვენ გააკეთეთ მართკუთხა ზოლი ფონისთვის ძალიან ფართო?

ნებისმიერი შეხედულება დასაფასებელია.


წლების განმავლობაში იმუნობლოტები არ გამიკეთებია და არც მაშინაა მათი რაოდენობრივი ანალიზი, ასე რომ გაფრთხილება. თუმცა:

1) "არსებობს რაიმე ხერხი იმის დასადგენად, თუ რამდენად ფართო გსურთ თქვენი ჯგუფი იყოს თქვენი ფონზე?"

მე ვიტყოდი, რომ ცენტრალური ზღვრის თეორემა დასაწყებად კარგი ადგილია. ძირითადად, რაც უფრო იზრდება თქვენი ფონის ზომა, ასევე იზრდება საშუალო ფონის ინტენსივობის შეფასების სიზუსტე (ასიმპტოტურად). ასე რომ თქვენ გინდათ თქვენი ფონის ნიმუში იყოს რაც შეიძლება დიდი.

ამას აქვს გარკვეული ვარაუდები:

  1. საშუალო ფონის საშუალო სიგნალის რეგიონალური რყევები

  2. (დაკავშირებული) გელის არტეფაქტების არარსებობა

ასე რომ, თქვენ გინდათ თქვენი ფონის ნიმუში იყოს რაც შეიძლება დიდი არტეფაქტების ჩათვლით და რამდენადაც ის წარმოადგენს თქვენი ჯგუფის ზოგად რეგიონში არსებული ლაქის გაფუჭებას. პრაქტიკაში, მე წარმომიდგენია, რომ თქვენი ცილის ზოლის შერჩევა ალბათ უმეტეს შემთხვევაში კარგია და, ალბათ, უფრო ადვილია ახსნა. თქვენ უბრალოდ უნდა აირჩიოთ წარმომადგენლობითი ფონი გასაზომად.

2) როგორ შეგიძლიათ იცოდეთ, თუ თქვენ გააკეთეთ მართკუთხა ზოლი ფონისთვის ძალიან ფართო?

ლაქზე ფართო უფრო ფართოა. უსასრულოდ დიდ ლაქაზე, მე ვფიქრობ, რომ თქვენ არ შეგიძლიათ გახადოთ ის ძალიან ფართო. პრაქტიკული მიზნებისათვის, თქვენ გინდათ რომ ის იყოს რაც შეიძლება ფართო და არ გადაფაროთ აშკარა არტეფაქტები ან ლაქის კიდე. მაგრამ ისევ და ისევ, ალბათ უფრო ადვილია ახსნა მხოლოდ ისეთი ფონის შერჩევა, როგორიც არის ცილის ზოლი, რომელიც უხეშად არის ცილის ზოლთან ახლოს, რათა მოხდეს ადგილობრივი ფონის ცვალებადობა.


ამ ეტაპზე ცილების ვიზუალიზაცია სასარგებლოა იმის დასადგენად, გადაადგილებულია თუ არა ცილები ერთნაირად და თანაბრად. გამოიყენეთ სპილენძის ლაქა, თუ თქვენ აპირებთ გამოყოფილი ცილების გარსზე გადატანას, რადგან Coomassie ლაქა შეუქცევადია. გამოიყენეთ მხოლოდ Coomassie ლაქა გელებზე გადატანის შემდგომ, რათა შეამოწმოთ გადაცემის ეფექტურობა, ან თუ თქვენ არ გეგმავთ გადაცემას და უბრალოდ გინდათ დააკვირდეთ SDS-PAGE გამოყოფის შედეგებს.

Coomassie ლაქა

როგორც კი ძალა გამორთულია გამოყოფილი ცილის ზოლები დაიწყება დიფუზურად (ისინი თავისუფლად ხსნადია წყალხსნარში). ცილების დიფუზიის თავიდან ასაცილებლად გელი დამუშავებულია 40% გამოხდილი წყლით, 10% ძმარმჟავით და 50% მეთანოლის ხსნარით, რაც იწვევს თითქმის ყველა ცილის ნალექს (გახდება ხსნადი).

ფიქსირებული ცილების ვიზუალიზაციისთვის გელი მოათავსეთ წყლის/ძმარმჟავას/მეთანოლის ერთსა და იმავე ნარევში, მაგრამ წონის 0,25% დამატებით Coomassie Brilliant Blue R-250. ინკუბაცია 4 სთ -ით ღამით ოთახის ტემპერატურაზე შერეკზე. გადაიტანეთ გელი (შეინახეთ საღებავის ნარევი, რომლის ხელახლა გამოყენებაც შესაძლებელია) 67.5% გამოხდილი წყლის, 7.5% ძმარმჟავას და 25% მეთანოლის ნარევში, მოათავსეთ შეიკერზე და ჩაანაცვლეთ გამრეცხვის ახალი ნარევით ჭარბ საღებავამდე. წაიშალა.

ლაქა აკრილამიდს არ შეაკავშირებს და დაიბანებს (დატოვებს გამჭვირვალე გელს). თუმცა, ის კვლავ მტკიცედ არის დაკავშირებული გელის ცილებთან და ისინი იღებენ ღრმა ლურჯ ფერს.

სპილენძის ლაქა

მოკლედ ჩამოიბანეთ ახლად ელექტროფორეზირებული გელები გამოხდილ წყალში (მაქსიმუმ 30 წმ) და შემდეგ გადაიტანეთ 0.3 მ CuCl ხსნარში2 5–15 წუთის განმავლობაში. მოკლედ გარეცხეთ გელები დეიონიზირებულ წყალში და დაათვალიერეთ ისინი ბნელი ველის ფონზე. ცილები წარმოიქმნება როგორც გამჭვირვალე ზონები გამჭვირვალე ცისფერ ფონზე. გელები შეიძლება მთლიანად განადგურდეს 0.1–0.25 მ ტრისში/0.25 მ EDTA pH 8.0 – ში განმეორებითი რეცხვით. გადაიტანეთ გელი გადასატან ბუფერულ ჭურჭელში გადაცემამდე, გადაცემის აპარატის მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად.


უჯრედის ლიზატი

უხეში ფიჭური ლიზატები არის საწყისი მასალის ყველაზე გავრცელებული უშუალო წყარო, რომელიც გამოიყენება ვესტერნ ბლოტინგში. მათი მომზადება შესაძლებელია უკვდავი უჯრედული ხაზებისგან, რომლებიც ცნობილია, რომ გამოხატავს სამიზნე ცილას, ან გადატანილი უჯრედებიდან, რომლებსაც აქვთ ცილის გამოხატვის ვექტორი. მრავალი განსხვავებული უჯრედის ტიპი (ძუძუმწოვარი, მწერი, საფუარი ან ბაქტერია) შეიძლება გამოყენებულ იქნას ცილის მომარაგებისთვის, რომელიც აუცილებელია მცირედი ცვალებადობით მომზადების პროცესში.

უმეტეს შემთხვევაში, უჯრედები იკრიფება, გარეცხილია და ლიზდება სამიზნე ცილის გასათავისუფლებლად. საუკეთესო შედეგისთვის, ყველა ეს ნაბიჯი უნდა ჩატარდეს ცივ ოთახში, ან ყინულზე. ეს მინიმუმამდე დაიყვანს პროტეოლიზს, დეფოსფორილირებას და დენატურაციას, ვინაიდან ეს ყველაფერი იწყება უჯრედების დარღვევისთანავე. შესაძლებელია უჯრედების ლიზირება უშუალოდ გელის ჩატვირთვის ბუფერში, თუ საჭიროა მხოლოდ სწრაფი შემოწმება. თუმცა, ხმის დამუშავება შეიძლება იყოს საჭირო მაღალი ბლანტი უჯრედული დნმ -ის დარღვევისათვის. ჩვეულებრივ, 20-50 მგ ფიჭური ლიზატი იტვირთება თითო ზოლზე გელის ელექტროფორეზისთვის.

სურათი 6: უჯრედები იკრიფება, გარეცხილია და ლიზდება ცილების გასათავისუფლებლად

ლიზისის შესაბამისი ბუფერის არჩევა და სათანადო მოცულობის განსაზღვრა ხშირად საცდელი და შეცდომის პროცესია, რომელზედაც გავლენას ახდენს იზოლირებული ცილის ტიპი და ასევე ცალკეული უჯრედები, რომლებიც გამოიყენება როგორც წყარო. ლიზის ბუფერები განსხვავდება ძალიან ნაზიდან სარეცხი საშუალებების გარეშე უფრო მკაცრ ხსნარებამდე, როგორიცაა rIPA (რადიოიმუნომონალექის ტესტი) ბუფერი, რომელიც დენატურირებადია და შეიცავს მრავალ სარეცხ საშუალებებს.

როგორც წესი, NP-40 (Nonidet P-40) ლიზის ბუფერი, უფრო რბილი არაიონური სარეცხი საშუალებით, გამოიყენება ხსნადი ციტოპლაზმური ცილების გამოყოფისთვის. სხვა დროს, rIPA ბუფერს ირჩევენ, რადგან ის ამცირებს ფონს და იმიტომ, რომ ზოგჯერ საჭიროა მრავალი სარეცხი საშუალება მემბრანით შეკრული ან ბირთვული ცილების სრულად გასათავისუფლებლად.

ასევე გასათვალისწინებელია ანტისხეული-ანტიგენის ურთიერთქმედება, რომელიც შეიძლება გავლენა იქონიოს ლიზის დროს სამიზნე ცილის ცვლილებებზე.

ლიზის ბუფერის რაოდენობა განისაზღვრება უჯრედების რაოდენობის მიხედვით, ან სხვაგვარად იგი შეფასებულია ქსოვილის კულტურის ჭურჭლის ზომის მიხედვით. თანდართულ ცხრილში მოცემულია რამდენიმე სავარაუდო საწყისი წერტილი.

ხანდახან მექანიკური დარღვევა, როგორიცაა სონიზაცია ან ჰომოგენიზაცია, საჭიროა გარკვეული უჯრედების და ქსოვილების სინჯებიდან ცილების სრულად გამოსაყოფად. Sonication ასევე გამოიყენება უჯრედული დნმ-ის გასანადგურებლად, რომელსაც შეუძლია ხელი შეუშალოს მისი მაღალი სიბლანტის გამო ან არასპეციფიკური შეკავშირების გამო. ლიზისისა და ცენტრიფუგირების შემდეგ იზომება ცილის რაოდენობა თითოეულ ლიზატში.

უჯრედის ლიზის მოცულობის რეკომენდაციები

უჯრედების ტიპი მასალის რაოდენობა ლიზის ბუფერის მოცულობა
ქსოვილის კულტურა 10 7 უჯრედი ან
კერძი 100 მმ
1 მლ
მთელი ქსოვილი 100 მგ დაამატეთ 2 მლ და დაასველეთ ან გააცივეთ ჰომოგენიზება
ბაქტერიები დაატრიალეთ ნიმუში, შეაფასეთ მოცულობა დაამატეთ 10 ტომი და მორევი
საფუარი დაატრიალეთ ნიმუში, შეაფასეთ მოცულობა დაამატეთ 10 ტომი, შემდეგ ხმება ან მორევა მინის მძივებით

სამეცნიერო გამომცემლები, დაფინანსების სააგენტოები და ბიოტექნოლოგიური და ფარმაცევტული კომპანიები დაინტერესებულნი არიან რაოდენობრივი ვესტერნ ლატებით. ჟურნალის სტანდარტები დასავლეთ ბლოტების გამოქვეყნებისათვის ბოლო წლებში უფრო მკაცრი გახდა. 5, 6, 7, 8, 9 მნიშვნელოვანია გავიგოთ ვესტერნების თეორია და ტექნიკა ცილის ზუსტი რაოდენობის მისაღებად. უფრო სანდო მონაცემებით, ჩვენ შეგვიძლია ავაშენოთ მყარი საფუძველი მომავლისთვის.

”მეორე შეშფოთება არის ნებისმიერი ლაბორატორიის ამჟამინდელი უუნარობა გამოაქვეყნოს გამოქვეყნებული ვესტერნ ბლოტები, რადგან ჟურნალებში გამოქვეყნებული დეტალები ვესტერნ ლათინგის შესახებ, როგორც წესი, მინიმალურია.”

R Ghosh et al. 4

თანაფარდობის ანალიზი

რატიომეტრიული გამოსახულება ადარებს ორი განსხვავებული სიგნალის ჩანაწერებს, რათა დაინახოს, არის თუ არა მსგავსება მათ შორის. ეს ხდება ერთი არხის მეორე არხზე გაყოფით, რათა წარმოიქმნას მესამე რატიომეტრიული არხი. ეს ტექნიკა სასარგებლოა, რადგან ის ასწორებს საღებავის გაჟონვას, საღებავის არათანაბარ დატვირთვას და ფოტო-გაუფერულებას. განაცხადის მაგალითი იქნება უჯრედშიდა იონის, pH- ის და ძაბვის დინამიკის გაზომვა რეალურ დროში.

ფონის გამოკლება საჭიროა ორმაგი არხის თანაფარდობის სურათების ანალიზამდე. იხილეთ ასევე ფონის კორექციის განყოფილება. ის თანაფარდობა_პროფილერი მოდული შეასრულებს ერთი ROI– ს რატიომეტრულ ანალიზს ორმაგი არხის შუალედურ სტეკზე. კენტი ნაჭრები არის 1 არხის სურათები და ლუწი ნაჭრები არის არხი 2 სურათები. თუ თქვენი ორი არხი იხსნება ცალკე დასტების სახით, მაგალითად Zeiss, ეს ორი არხი შეიძლება ერთმანეთზე იყოს დაშვებული (ერთმანეთში მონაცვლეობით შერეული) მენიუს ბრძანებით Plugins ›Stacks - Shuffling› Stack Interleaver.

მოდული გამოიმუშავებს თანაფარდობის მნიშვნელობების მწვანე ნაკვეთს. Ch1 ÷ Ch2 არის ნაგულისხმევი და შეგიძლიათ მიიღოთ Ch2 ÷ Ch1 თუ მოდული გაშვებულია ⌥ Alt ღილაკით ქვემოთ. ის ასევე გამოიმუშავებს ცალკეული არხების ინტენსივობის მეორე ნაკვეთს, Ch1 და Ch2, ასევე შედეგების ცხრილს.

შედეგების ცხრილის პირველი სტრიქონი შეიცავს მნიშვნელობებს ROI– ს x, y, სიგანისა და სიმაღლისთვის.

მეორე რიგიდან ქვევით, პირველი სვეტი არის დრო (ნაჭრის ნომერი), მეორე სვეტი არის Ch1 საშუალო ინტენსივობა, ხოლო მესამე არხი არის Ch2 საშუალო ინტენსივობა და თანაფარდობის მნიშვნელობა. დასტის კალიბრირებული უნდა იყოს ჩარჩოს ინტერვალი, რათა "დროის" მნიშვნელობა წამებში იყოს. წინააღმდეგ შემთხვევაში, ეს არის "ნაჭრები". ჩარჩო ინტერვალის დაყენება შესაძლებელია დასტისთვის მენიუს ბრძანების მეშვეობით Image ›Properties.

ეს ცხრილი შეიძლება გადაწერილი იყოს ბუფერში და ჩასვათ სხვაგან მენიუს ბრძანებით "Edit› Copy All ".

თანაფარდობის ანალიზი ROI მენეჯერის გამოყენებით

1. გამოაკელით ფონი სურათისგან.

2. გახსენით ROI მენეჯერი (გაანალიზეთ s ინსტრუმენტები ›ROI მენეჯერი…) და დააწკაპუნეთ ღილაკზე„ აჩვენე ყველა “.

3. შეარჩიეთ გასაანალიზებელი უჯრედები და დაამატეთ ისინი ROI მენეჯერში (ღილაკი "დამატება" ან კლავიატურა T გასაღები).

შედეგების ფანჯარა შეიცავს ch1 და ch2 საშუალო და მათ თანაფარდობას. თითოეული რიგი არის დროის წერტილი (ნაჭერი). პირველი რიგი შეიცავს ROI დეტალებს.

საცნობარო სურათის შესაქმნელად:

  1. გაასწორეთ დასტა მენიუს ბრძანებით (სურათი acks დასტები ›Z- პროექტი" პროექციის ტიპი: მაქსიმალური "),
  2. საჭიროების შემთხვევაში შეცვალეთ სიკაშკაშე და კონტრასტი.
  3. შეარჩიეთ ახალი სურათი და დააწკაპუნეთ ღილაკზე „მეტი“ ROI მენეჯერში. ამის შემდეგ აირჩიეთ "ეტიკეტი".

მშობლიური ამერიკული წარმოშობა: როდესაც დნმ ორი მიმართულებით მიუთითებს

მეცნიერები აანალიზებენ ძველ და თანამედროვე დნმ -ს, რათა მეტი გაიგონ იმაზე, თუ როგორ კოლონიზებდნენ ადამიანები პირველად ამერიკას. აქ ნაჩვენებია: ინსტრუმენტები აღმოაჩინეს 1968 წელს, კლოვისის ეპოქაში, დასავლეთ მონტანაში, 12 000 წელზე მეტი ხნის წინ გარდაცვლილი ბიჭის ნაშთებთან ერთად, რომელიც ცნობილია როგორც ანზიკ -1. ბავშვის დნმ გამოიყენებოდა, როგორც შედარების საფუძველი სამშაბათს გამოქვეყნებულ ორ ახალ გენეტიკურ კვლევაში.

ამ კვირაში მეცნიერთა ორმა გუნდმა გამოაქვეყნა მოხსენებები, სადაც დეტალურად იყო აღწერილი მშობლიური ამერიკელი ხალხების წარმოშობა. ორივე ჯგუფმა შეისწავლა უძველესი და თანამედროვე დნმ, რათა ეცადოს მეტი გაეგო მოსახლეობის გადაადგილების შესახებ აზიიდან ახალ სამყაროში და იმაზე, თუ როგორ შეერია ჯგუფები აქ მოხვედრისთანავე. ორივემ აღმოაჩინა მინიშნება, რომ სამხრეთ ამერიკაში მცხოვრები ზოგიერთი ამერიკელი მშობელი ავსტრალიისა და მელანეზიის მკვიდრ ხალხებს ეკუთვნის.

მაგრამ ორივე ჯგუფმა განსხვავებული დასკვნები გამოიტანა, როდესაც მივიდა იმაზე, თუ როგორ მიაღწია იმ დნმ -მ ოკეანიასთან კავშირებს მშობლიური ამერიკის გენომში.

ჟურნალ Science– ის ფართო ნაშრომში, კოპენჰაგენის უნივერსიტეტის გეოგენეტიკის ცენტრის დირექტორმა ესკე ვილერსლევმა და თანაავტორებმა შეისწავლეს გენომები ამერიკისა და აზიის უძველესი და თანამედროვე ადამიანებისგან. მათ დაასკვნეს, რომ ახალ სამყაროში მიგრაცია უნდა მომხდარიყო ციმბირიდან ერთ ტალღაზე, დროებით არა უადრეს 23,000 წლის წინ. მათ ასევე გამოთვალეს, რომ ავსტრალო-მელანეზიელ ხალხთან გაზიარებული ნებისმიერი გენი უნდა იყოს წვლილი შეტანილი შედარებით ბოლოდროინდელი მოსახლეობის შერევით.

ამასობაში, ჰარვარდის სამედიცინო სკოლის გენეტიკოსმა დევიდ რაიხმა და მისმა კოლეგებმა, რომლებიც უფრო მჭიდროდ ამახვილებენ ყურადღებას ავსტრალო-მელანეზიურ გენებზე კვლევაში გამოქვეყნებულ კვლევაში, მივიდნენ განსხვავებულ დასკვნამდე: რომ დნმ უნდა ყოფილიყო ამერიკაში დიდი ხნის წინ და რომ მიგრაცია მოხდა ერთზე მეტ ტალღაზე.

”ეს იყო გიჟური და მოულოდნელი და ძალიან უცნაური და ჩვენ გავატარეთ ბოლო წელიწადნახევარი მის გასაგებად,” - თქვა რაიხმა ორშაბათს. მაგრამ ”ეს შეუსაბამოა ერთი დამფუძნებელი მოსახლეობისთვის. ამაზონიაში მცხოვრებ ხალხს ორი განსხვავებული წყარო აქვთ. ჩვენ ვფიქრობთ, რომ ეს არის რეალური დაკვირვება. ”

დავით მელცერმა, დალასის სამხრეთ მეთოდისტური უნივერსიტეტის არქეოლოგმა და სამეცნიერო ნაშრომის თანაავტორმა, თქვა, რომ მისი დარგის მკვლევარები საუკუნეების განმავლობაში ეჭიდებოდნენ ამერიკის ადრეულ ისტორიას - მსჯელობდნენ იმაზე, თუ როდის ჩავიდნენ აქ პირველი დასახლებული პირები, იყო თუ არა ისინი მიგრაციის იმპულსები და ა.შ.

მაგრამ იქ, სადაც არქეოლოგები ძალიან კარგად ფლობენ ფიზიკურ არტეფაქტებს და იყენებენ მათ იმის გასარკვევად, რომ ადამიანები უნდა დასახლდნენ ამერიკაში გარკვეული დროით (დაახლოებით 15,000 წლის წინ), მათ არ შეუძლიათ გაარკვიონ გენეტიკოსთა ისტორიის სხვა დეტალები. დნმ-ის თანმიმდევრობისა და ანალიზის უახლესი მიღწევების წყალობით, შესანიშნავად აღჭურვილია შესასწავლად.

სამეცნიერო ნაშრომი შეეცადა ამ დეტალების გარკვევას. გუნდმა გამოთვალა, რომ მშობლიური ამერიკელი მოსახლეობა აზიური ჯგუფებიდან 23 000 წლის წინ განსხვავდებოდა,-თქვა თანაავტორმა იუნ სონგმა, ბერკლის უნივერსიტეტის გამომთვლელმა ბიოლოგმა.

მათ ასევე შეაფასეს, რომ ჩრდილოეთ ამერიკისა და სამხრეთ ამერიკის მოსახლეობა გაიყო 12,000 და 15,000 წლის წინ და რომ იყო ”დამატებითი ტალღის შემდგომი მიგრაციის მტკიცებულება” - მათ შორის ავსტრალიისა და მიკრონეზიის ადგილობრივ ხალხებთან გაზიარებული დნმ -ის ჩათვლით.

სონგს არ ეგონა, რომ მეცნიერების შესწავლა და ბუნების კვლევები აუცილებლად არათანმიმდევრული იყო და დაინტერესდა, იყო თუ არა ერთ – ერთი შესაძლო სცენარი ბუნების ნაშრომში - „სტრუქტურირებული გენის ნაკადის ხანგრძლივი პერიოდი. წყარო, ”იგივე იყო რაც მისი გუნდის წარმოდგენა საწყის ტალღაზე მომდევნო მიგრაციებთან ერთად.

”შესაძლოა დაბნეულობა სემანტიკაა”, - თქვა მან.

ვისკონსინ-მედისონის უნივერსიტეტის ანთროპოლოგიის პროფესორი ჯონ ჰოუქსი, რომელიც არცერთ კვლევაში არ მონაწილეობდა, დაეთანხმა, რომ ორივე გუნდის მონაცემებმა ბევრი მსგავსება აჩვენა. მისი თქმით, ის მიდრეკილი იყო მეტი მარაგის განთავსებაზე მეცნიერების კვლევაში, რადგან მისი დასკვნების გამოტანა უფრო მეტად იყო დამოკიდებული ძველ დნმ -ის თანმიმდევრობაზე. მან დაამატა, რომ მომავალში უფრო მეტმა შერჩევამ შესაძლოა გამოავლინოს მეორე უძველესი მიგრაციის მტკიცებულება.

რაიხი, რომელმაც თქვა, რომ მისმა გუნდმა ჩაატარა მრავალი შემოწმება მისი ჰიპოთეზის დასადასტურებლად, რომ არსებობდა ორი დამფუძნებელი ჯგუფი, მეცნიერები ელოდნენ, რომ საბოლოოდ დაადასტურებდნენ საგვარეულო ჯგუფის არსებობას, რომელსაც მან უწოდა "პოპულაცია Y" - იპიკუერას შემდეგ, ტუპის სიტყვა "წინაპარი".

”არსებობს მოჩვენებების პოპულაციის პროგნოზირების ისტორია”, - თქვა მან. ”ხალხი იპოვის ამ მოსახლეობას Y.”

მელცერმა, თვითგამოცხადებულმა "ქანების ბიჭმა", თქვა, რომ ეს აზრი აღელვებდა მას. მეცნიერებს არ აქვთ დნმ -ის ნიმუშები მშობლიური ამერიკელებისგან, რომლებიც დათარიღებულია დაახლოებით 12,000 -დან 24,000 წლის წინ. მაგრამ თუ ისინი უზრუნველყოფენ ნიმუშს, მათ შეეძლებათ მისი თანმიმდევრობა და მოძებნონ ავსტრალო-მელანეზიური დნმ-ის მინიშნებები.

”თუ ჩვენ ვიპოვით ამ [გენეტიკურ] სიგნალს, კარგი - ეს არის ჩვენი პასუხი,” - თქვა მან.

მეცნიერებისა და ჯანმრთელობის შესახებ მეტი ინფორმაციის მისაღებად, გამომყევით Twitter– ზე: @LATerynbrown


გამორჩეული ვებგვერდი გაიგეთ ის ფაქტორები, რომლებიც გადამწყვეტია წარმატებული ვესტერნ ბლოტირებისთვის

შემოგვიერთდით Bio-Rad ვესტერნის დაბლოკვის ექსპერტ კენეტ ოჰთან და მის სტუმრებთან ერთად ვებინარული სერიისთვის, რომელიც შეისწავლის მრავალ ფაქტორს, რომლებიც გავლენას ახდენს წარმატებული და განმეორებადი უესტერნ ბლოტების დიზაინსა და შესრულებაზე. ქიმილუმინესცენცია ან ფლუორესცენცია, თვისობრივი თუ რაოდენობრივი ლაქა, არა მხოლოდ განვიხილავთ როგორ-ს, არამედ უფრო ღრმად ჩავუღრმავდებით და განვიხილავთ რატომ.

ვესტერნ ბლოტის მონაცემების საიმედო კვანტიფიკაცია

დოქტორი S.C Taylor ადარებს იდენტური ლაქების წარმოქმნის შედეგებს კამერაზე დაფუძნებულ გამოსახულების ტექნოლოგიებსა და ფილმს. ისწავლეთ ფილმისა და დენსიტომეტრიულ ანალიზთან დაკავშირებული საერთო ნაკლოვანებები.

ვესტერნ ბლოტის რაოდენობრივი ექსპერიმენტის შემუშავება, რათა თავიდან ავიცილოთ საერთო ხაფანგები

ვესტერნ ბლოტის რაოდენობრივი მეთოდიკა აღწერილია მყარი ექსპერიმენტული დიზაინისა და მონაცემთა ანალიზის ფოკუსირებით, რათა რეპროდუქციულ, გამოქვეყნების ხარისხის შედეგებს მიაღწიოს უმოკლეს ვადებში.

რაოდენობრივი ვესტერნ ბლოტინგი: ოპტიმიზაცია არის მთავარი

რაოდენობრივი უესტერნ ბლოტის მუშაობის თითოეული ეტაპი განიხილება ოპტიმიზაციით, რათა უზრუნველყოს რაოდენობრივი, რეპროდუქციული საბოლოო მონაცემები, რომლებიც ასახავს ექსპერიმენტულ პირობებს.

გამოსახულების ლაბორატორია

Image Lab Touch პროგრამული რესურსები

Bio-Rad გთავაზობთ სასწავლო ვიდეოებს Image Lab Touch Software 2.4– ისთვის, რომელიც მოიცავს ChemiDoc MP გამოსახულების სისტემის ძირითად პროგრამებს. თემები მოიცავს, შესვლას, Smart Tray Technology- ს, თქვენი სურათის გადაღებას და მონაცემების ექსპორტს.

Image Lab პროგრამული რესურსები

Bio-Rad გთავაზობთ გაკვეთილებს გამოსახულების ლაბორატორიის პროგრამული უზრუნველყოფის 6.0.1 ძირითადი შეძენისა და მოწინავე ანალიზისათვის. თემები მოიცავს, დენსიტომეტრიულ ანალიზს, მოლეკულურ წონას, ნორმალიზებას, სიწმინდის შეფასებას და სხვა!

განაცხადის სახელმძღვანელო

ვესტერნ ბლოტის ექიმი პრობლემების მოგვარების გზამკვლევი

ჩვენი თვითდახმარების პრობლემების აღმოფხვრის სახელმძღვანელო მოიცავს გადაწყვეტილებებს მრავალი საერთო და არც თუ ისე გავრცელებული ვესტერნ ბლოტირების საკითხებზე და ეხმარება თქვენს ლაქებს გამოიყურებოდეს საუკეთესოდ.

პროტეინის დაბინძურების გზამკვლევი (PDF 7.9 მბ)

დეტალები გაფუჭების ტექნოლოგიის, ხელმისაწვდომი პროდუქტებისა და მეთოდების შესახებ, პლუს რჩევები, ტექნიკა და პრობლემების აღმოფხვრა.

ელექტროფორეზის გზამკვლევი (PDF 6.4 MB)

სახელმძღვანელო პოლიაქრილამიდის გელის ელექტროფორეზისა და ცილის გამოვლენისათვის, მათ შორის თეორია, პროდუქტის შერჩევა, პროტოკოლები და სხვა.

დოკუმენტების ბიბლიოთეკა

ბროშურა ChemiDoc MP System (PDF 1.26 MB)

გამოიკვლიეთ ახალი მაღალი დონის ვიზუალიზაციის სისტემის მახასიათებლები და სარგებელი საუკეთესო ფლუორესცენციისა და ქიმილუმინესცენციის გამოსავლენად.

ლაქებისგან თავისუფალი მიდგომა ვესტერნ ბლოტინგზე (PDF 864 კბ)

ისწავლეთ როგორ გამოიყენოთ ლაქების თავისუფალი ტექნოლოგია ცილების მთლიანი ნორმალიზებისთვის, როგორც სტანდარტული ლაქების ნორმალიზაციის პროცესის ალტერნატივა.

ბროშურა ვესტერნის დაბინძურებისგან შეღებვის გარეშე (PDF 593 კბ)

ნახეთ, თუ როგორ ადარებს შეღებვის გარეშე დასავლური სამუშაო ნაკადი ტრადიციულ ვესტერნ ლათინგის სამუშაო ნაკადებს.

სათანადო ნიმუშის დატვირთვის განსაზღვრა ლაქების გარეშე ვესტერნ ბლოტის შესრულებისას (182 კბ)

საოჯახო ცილის გამოხატვის თანმიმდევრულობის დადასტურება (198 კბ)

პუბლიკაციები

ვესტერნ ბლოტის მონაცემების საიმედო რაოდენობრივი განსაზღვრის განსაზღვრული მეთოდიკა

გაეცანით მეთოდოლოგიას საიმედო რაოდენობრივი მონაცემების მისაღებად ქიმილუმინესცენციური ვესტერნის ლაქებისგან სტანდარტიზაციის პროცედურების გამოყენებით განახლებულ რეაგენტებთან და გამოვლენის მეთოდებთან ერთად.

ვესტერნ ბლოტის რაოდენობრივი ექსპერიმენტის დიზაინი

წაიკითხეთ შეჯამება ვესტერნ ბლოტის სრული მუშაობის შესახებ, ფოკუსირება ნიმუშის მომზადებაზე და მონაცემების ანალიზზე რაოდენობრივი ვესტერნ ბლოტირებისთვის.


ᲞᲠᲝᲪᲔᲓᲣᲠᲐ

გელის მომზადება (ᲓᲠᲝᲘᲡ ᲒᲐᲜᲐᲬᲘᲚᲔᲑᲐ σ სთ)

თუ კომერციულად ხელმისაწვდომი წინასწარი ჩამოსხმის გელები გამოიყენება, გადადით მე –4 საფეხურზე (წინასწარი ელექტროფორეზი).

დარწმუნდით, რომ გელის ფირფიტები, შუასადებები და სავარცხელი სუფთაა. ამოიღეთ თითის ანაბეჭდები ან სხვა ნარჩენები მინის ფირფიტებიდან მეთანოლით გაჯერებული ტამპონით. გაგრძელებამდე დარწმუნდით, რომ ყველა კომპონენტი მშრალია.

მოამზადეთ პოლიმერიზაციის ნარევი. ერთი გელისთვის საჭირო რეაგენტების რაოდენობა 0.08 × 12 × 18 სმ (ნომინალური მოცულობა 17.8 მლ), რომელიც შეიცავს 5% �% ვ/ვ პოლიაკრილამიდს, ნაჩვენებია ცხრილში 4.

!ᲡᲘᲤᲠᲗᲮᲘᲚᲘᲗ აკრილამიდი და ბისაკრილამიდი ნეიროტოქსინებია. ატარეთ ხელთათმანები და გამოიყენეთ თვალის დაცვა პოლიმერიზაციის ხსნარის დამუშავებისას. არასოდეს პიპეტით გამოსავალი პირით.

კრიტიკული ნაბიჯი საფუძვლიანად გაჟღენთილი ხსნარების პოლიმერიზაცია შეიძლება იყოს სწრაფი. სიბლანტე შეიძლება იყოს ძალიან დიდი, რათა არ მოხდეს ხსნარის ჩაყრა ან გადატანა პიპეტით შიგნით

5 წუთი. ამიტომ, არ დაიწყოთ პოლიმერიზაციის რეაქცია, სანამ მზად არ იქნებით გელის ჩამოსხმისთვის.

ჩაასხით პოლიმერიზაციის ნარევი შუშის ფირფიტაში, თავიდან აიცილოთ ბუშტუკების წარმოქმნა. ჩადეთ კარგად ფორმირებული სავარცხელი დაუყოვნებლივ და დაუშვით გელი პოლიმერიზირდეს მინიმუმ 2 სთ. ალტერნატიულად, წინასწარ მომზადებული მშობლიური გელის შეძენა შესაძლებელია გამყიდველებისგან და პროტოკოლის დაწყება მე –4 საფეხურიდან.

კრიტიკული ნაბიჯი თავიდან აიცილოთ ბუშტების წარმოქმნა. მას შემდეგ, რაც ბუშტები არ ატარებენ ელექტრულ დენს, ისინი არღვევენ ელექტროფორეტიკურ მიგრაციას. ამრიგად, მნიშვნელოვანია პოლიმერიზაციის დროს ჩარჩენილი ბუშტების რაოდენობისა და ზომის შემცირება. დაასხით პოლიმერიზაციის ნარევი ნელა, რათა თავიდან აიცილოთ ბუშტუკების წარმოქმნა. გელი-ფირფიტის ასამბლეის 45 ° ვერტიკალურიდან გადახრა შეიძლება შეამციროს ბუშტუკების წარმოქმნა ჩამოსხმის დროს. თუ ბუშტუკები ხსნარშია ჩაფლული, დაასხით დასრულება, დადგით შეკრება ბოლომდე ისე, რომ ფირფიტები ვერტიკალური იყოს და ნაზად დააკაკუნეთ ასამბლეაში სპატულით, რათა ბუშტუკები ამოიღონ. მას შემდეგ, რაც ბუშტუკები ამოიფრქვევა ხსნარის თავზე, კარგად ჩამოსაყალიბებელი სავარცხლის ჩასვლამდე ისინი უნდა ამოიჭრას ან მოიხსნას.

პაუზის წერტილი პოლიმერიზებული გელები შეიძლება ინახებოდეს ოთახის ტემპერატურაზე, ღია კიდეებით დალუქული პლასტიკური ფილმით, რამდენიმე საათის განმავლობაში ან 1 კვირამდე 4 ଌ და 100% ტენიანობაზე. ჩვენ ვიყენებთ პლასტმასის ყუთს მაცივარში ამ მიზნით. ყუთის გვერდზე მიმაგრებული და წყლით გაჯერებული ქაღალდის ფითილი საკმარისია ტენიანობის შესანარჩუნებლად.

წინასწარი ელექტროფორეზი (ᲓᲠᲝᲘᲡ ᲒᲐᲜᲐᲬᲘᲚᲔᲑᲐ 0.5 𠄱.0 სთ)

4. ამოიღეთ სავარცხელი და ქვედა გამყოფი (თუ გამოიყენება) გელიდან და დააინსტალირეთ გელი ვერტიკალურ ელექტროფორეზის აპარატში.

5. შეავსეთ ზედა და ქვედა ბუფერული რეზერვუარები ელექტროფორეზის გამშვები ბუფერით. ზემოთ მოცემული პოლიმერიზაციის პროტოკოლით მიღებული გელებისთვის, შესაბამისი ხსნარი არის 1X კონცენტრირებული TAE ბუფერი. გამოიყენეთ პასტერის პიპეტი, რომ ჩამოიბანოთ ნიმუშის ჭაბურღილის ზედაპირები ბუფერული საშუალებით, რათა დარწმუნდეთ, რომ ნამსხვრევები არ არის. პასტერის პიპეტი 90 ° მოსახვევით ვიწრო ბოლოში შეიძლება გამოსადეგი იყოს გელის ფსკერზე შეკავებული ჰაერის ბუშტუკების გადასაადგილებლად.

კრიტიკული ნაბიჯი დამუხტული რეაგენტები, რომლებიც შეუთავსებელია გელის პოლიმერიზაციის რეაქციასთან, შეიძლება გადავიდეს გელში ელექტროფორეზის საშუალებით. ელექტროფორეზის დაწყებამდე საინტერესო რეაქტივის შესაბამისი კონცენტრაცია შერეულია გაშვებულ ბუფერთან. ამის მაგალითია ნახ. 1 -ში ნაჩვენები ანალიზის ელექტროფორეზის ბუფერში cAMP- ის ჩართვა.

5 და#x003bcL 1X საღებავები + გლიცეროლის ხსნარი გელის თითოეულ ჭაბურღილში და ჩაატარეთ წინასწარი ელექტროფორეზი

10 ვ/სმ გელის სიგრძე. შეამცირეთ ეს ძაბვა, თუ გელის გათბობა აშკარაა.

კრიტიკული ნაბიჯი საღებავის მიგრაციის ნიმუში ამოწმებს არის თუ არა გელის სიმკვრივე და გამტარობა ერთგვაროვანი და ავლენს ნიმუშის ფორმის რაიმე დეფექტს. გადაყარეთ ნებისმიერი ლარი, რომელიც ამ ეტაპზე არ იძლევა ვიწრო, კარგად გამხსნელ საღებავებს.

ნიმუშის მომზადება და წონასწორობა (ᲓᲠᲝᲘᲡ ᲒᲐᲜᲐᲬᲘᲚᲔᲑᲐ 1 𠄱.5 სთ)

7. მოამზადეთ ნიმუშები და დააბალანსეთ 30 წუთის განმავლობაში 20 ± 1 ଌ ტემპერატურაზე. ეს შეიძლება განხორციელდეს ნაწილობრივ, სანამ ლარი გადის წინასწარ ელექტროფორეზს. ტიტრაციის ოქმი ჩვეულებრივ გამოიყენება ცილის ოპტიმალური კონცენტრაციის დასადგენად, რომელიც საჭიროა ნუკლეინის მჟავის მუდმივ რაოდენობასთან ურთიერთქმედებისათვის. ნიმუშის ცვალებადობა მინიმუმამდეა დაყვანილი იმ კომპონენტების წინასწარ შერევით, რომლებიც იმყოფებიან მუდმივ კონცენტრაციებში და ამ ხსნარის მუდმივი მოცულობის განაწილებას ცალკეულ ნიმუშის მილებში. ყველა არაპროტეინული კომპონენტი უნდა იყოს შერეული და მიიყვანოს რეაქციის ტემპერატურაზე ცილის დამატებამდე. ეს უზრუნველყოფს, რომ ცილა შეხვდეს ხსნარის ყველა კომპონენტს მათი საბოლოო კონცენტრაციებთან ახლოს. როგორც მაგალითი, ტიპური ტიტრაციული ოქმი, რომელიც გამოიყენება CAP- დნმ ურთიერთქმედების შესასწავლად, მოცემულია ცხრილში 5. გაითვალისწინეთ, რომ cAMP არის სპეციალური დანამატი, რომელიც საჭიროა ამ მოლეკულურ სისტემაში დნმ-ის დამაკავშირებელი თანმიმდევრობით.

ცხრილი 5

ნახაზში ნაჩვენები ანალიზისათვის სავალდებულო რეაქციების შემადგენლობა.

Კომპონენტინიმუში
მე
მოცულობა μL
10X შემაკავშირებელი ბუფერი: 100 მლ Tris (pH 7.5 20 ଌ), 10 მმ EDTA, 1 M KCl, 1 მლ DTT, 50% v/v გლიცეროლი, 0.10 მგ/მლ BSA3333333333
32 P დნმ: 214 bp lაკ პრომოუტერ-ოპერატორის ფრაგმენტი 48, 1.25 × 10 𢄨 მ,

კრიტიკული ნაბიჯი წონასწორობის დრო დამოკიდებული იქნება ურთიერთქმედების მოლეკულების იდენტურობაზე და რეაქციის ბევრ პირობებზე (მაგალითები მოიცავს, მაგრამ არ შემოიფარგლება მხოლოდ ტემპერატურით, ცილებისა და ნუკლეინის მჟავების კონცენტრაციით და მარილის კონცენტრაციით). წონასწორობის მიღწევამ შეიძლება გამოიწვიოს გამოუსწორებელი შედეგები. წონასწორობის მიღწევის მინიმალური კონტროლი არის თითოეული ნიმუშის გაყოფა ანალიზში ორ ნაწილად და ერთი ქვეჯგუფის ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში, ხოლო მეორე ქვესიმრავლე 60 წუთის განმავლობაში (ან მეტი). გაანალიზეთ ნარევები იდენტური ელექტროფორეზის პირობების გამოყენებით. შეკრული და თავისუფალი ნუკლეინის მჟავების თანაბარი mole- ფრაქციები შესაბამის ნიმუშებში არის დამაკავშირებელი წონასწორობის მჭიდრო მიდგომის მტკიცებულება.

ელექტროფორეზი (ᲓᲠᲝᲘᲡ ᲒᲐᲜᲐᲬᲘᲚᲔᲑᲐ 30 წთ-5 სთ დამოკიდებულია საჭირო ელექტროფორეზული გარჩევადობა)

8. წონასწორობის პერიოდის ბოლოს, ჩამოიბანეთ გელის ჭაბურღილები და დატვირთეთ ნიმუშები. ნახ. 1 -ში ნაჩვენები ექსპერიმენტისას (რეაქციის კომპოზიციები მოცემულია ცხრილში 5), მთელი ნიმუში (30 μL) დატვირთულია. თუმცა, შესაძლებელია ნიმუშის უფრო მცირე მოცულობის გამოყენება (პრაქტიკული ქვედა ზღვარი დაწესებულია ჭის ქვედა ზედაპირის ტიპური გელის ერთგვაროვანი ფენის დაფარვის აუცილებლობით, ეს შეიძლება იყოს 5 და#x003bcL). მცირე ზომის ნიმუშები მომგებიანია, რადგან ისინი წარმოქმნიან ვიწრო საწყის ზონებს ელექტროფორეზის დასაწყისში და, შესაბამისად, უფრო მკვეთრ ზოლს ელექტროფორეზის ბოლოს.

გელის ჩატვირთვა მოხერხებულად ხდება ჰაერის გადაადგილების პიპეტორის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია ვიწრო ხრახნიანი და#x0201cgel-loading ” რჩევებით (იხ. აღჭურვილობის სია, ზემოთ). ბევრი ნიმუშის კომპოზიცია საკმარისად მკვრივია იმისათვის, რომ სუფთად დაიფაროს ნიმუშის ჭაბურღილების ბოლოში. მათთვის, ვინც არ არის, გლიცეროლის ჩართვა საბოლოო კონცენტრაციაში 2 𠄵% v/v ხელს შეუწყობს დატვირთვას. (ბევრი სხვა მკვრივი ხსნარი ერთნაირად კარგად მუშაობს ამ მიზნით.) მოათავსეთ დატვირთული წვერი გელის ზედაპირიდან 1 მმ -ში და ნელ -ნელა გამოდევნეთ ნიმუში. მოერიდეთ ნიმუშის შემდეგ ჰაერის ბუშტის გამოდევნას, ვინაიდან ეს იწვევს ტურბულენტობას დაარღვევს დაურღვეველი ნიმუშის ვიწრო ზონას.

9. ჩატვირთეთ თვალთვალის საღებავი გვერდით, გამოუყენებელ ჭაბურღილში მარკერის სახით და შეასრულეთ ელექტროფორეზი 10 ვ/სმ -ზე. შეამცირეთ ძაბვა, თუ გელი გახდება თბილი ელექტროფორეზის დროს. კომპლექსური დისოციაციის შესამცირებლად, ელექტროფორეზის ინტერვალი უნდა იყოს რაც შეიძლება მოკლე, თანხვედრაში ინტერესთა სახეობების გადაწყვეტასთან. გაითვალისწინეთ, რომ ზოგიერთ მოლეკულურ სისტემას არ აწუხებს ნიმუშებზე საღებავების დამატება. ამ სისტემებისთვის მოსახერხებელია საღებავების დამატება უშუალოდ ნიმუშებზე, გელის ჩატვირთვამდე.

ელექტროფორეტული ზოლების გამოვლენა (ᲓᲠᲝᲘᲡ ᲒᲐᲜᲐᲬᲘᲚᲔᲑᲐ 30 წუთიდან რამდენიმე დღემდე, დამოკიდებულია ნიმუშის რადიოაქტიურობაზე)

10. ელექტროფორეზის დასასრულს ამოიღეთ გელისა და ფირფიტის ასამბლეა ელექტროფორეზის აპარატიდან და საგულდაგულოდ გააშრეთ ქაღალდის პირსახოცებით.

კრიტიკული ნაბიჯი ფირფიტების გამოყოფამდე გელი და ფირფიტა უნდა იყოს მშრალი. ფირფიტებს შორის შემორჩენილმა ბუფერმა შეიძლება ხელი შეუწყოს ვაკუუმის წარმოქმნას, რადგან ფირფიტები დაშლილია და ამან შეიძლება დაამახინჯოს გელი. გარდა ამისა, თავისუფალი ბუფერის გადატანა გელის ზედაპირზე შეიძლება გამოიწვიოს რადიოაქტიური ნუკლეინის მჟავის გამოყოფა გელიდან შემდგომი საფეხურების განმავლობაში. ეს რადიოიზოტოპი არის უსიამოვნო შეგრძნება ავტორადიოგრაფიისა და უსაფრთხოების პოტენციური საფრთხის წინაშე.

11. ნაზად გამოყავით ფირფიტები, დატოვეთ გელი ერთ ფირფიტაზე. გადაიტანეთ გელი და ფირფიტა პლასტმასის საკვების ერთ ფენაში. გელის შეფუთული ზედაპირი უნდა იყოს ჰაერის ბუშტებისა და ნაოჭების გარეშე, რადგან ეს ხელს შეუშლის აუტორადიოგრაფიას. ხანმოკლე (≤ 24 სთ) ავტორადიოგრაფიული ექსპოზიციისათვის ეს მომზადება საკმარისია. უფრო გრძელი ექსპოზიციისთვის, ქაღალდის ან მემბრანის საყრდენზე გელის გაშრობა ან მისი გაყინვა � ଌ (იხ. ქვემოთ) შეამცირებს დიაპაზონის გამო ზოლების გაფართოებას.

12. ავტორადიოგრაფია. მუშაობა შესაბამის ბნელ ოთახში (ფილმის ავტორადიოგრაფიისთვის) ან ლაბორატორიაში მკრთალი შუქით (ფოსფორის ეკრანის ავტორადიოგრაფიისთვის) განათავსეთ ფილმი ან ფოსფორის ეკრანი ექსპოზიციის კასეტაში. მოათავსეთ შეფუთული გელი და ფირფიტა კასეტაში, გელის გვერდით ფილმის ან ეკრანისკენ. დახურეთ კასეტა. გამოაქვეყნეთ ფილმი ან ეკრანი 4 ଌ ტემპერატურაზე ინტერვალით 24 სთ -მდე, ხოლო � ଌ უფრო გრძელი ინტერვალებით. შენიშვნა: მოქნილი მუყაოს ან პლასტიკური ფილმის კასეტები უკეთესად იტევს მინის გელის ფირფიტებს, ვიდრე ტრადიციული ხისტი ლითონის კასეტა, მაგრამ ისინი არ შთანთქავენ გელის მიერ გამოყოფილ ბეტა რადიაციას. თუ კასეტები დაგებულია ექსპოზიციის ინტერვალის დროს, მათი პლექსიგლასის ფურცლებით გამოყოფა (5 მმ სისქის) შეამცირებს მიმდებარე ფილმების ან ფოსფორის ეკრანების ჯვარედინი ექსპოზიციის დაბინდვას. ექსპოზიციის პერიოდის ბოლოს, შეიმუშავეთ ფარული სურათი ფოსფორის ეკრანზე ან ფილმზე, მწარმოებლისა და#x02019 ინსტრუქციის შესაბამისად. გელის სურათების მაგალითი ნაჩვენებია ფიგურებში 1 და#x02013 4.

ყველა ნიმუში შეიცავდა 214 bp E. coli lac პრომოუტერ-ოპერატორი დნმ 90 (3.7 × 10 � მ). B-h ნიმუშები შეიცავდა CAP ცილას (7.1 × 10 𢄩 მ). ნიმუშები c-h შეიცავს ლაკ რეპრესორი 0.7, 1.5, 2.2, 2.9, 3.6 და 7.3 × 10 𢄩 M შესაბამისად. შემაკავშირებელი ბუფერი იყო 10 მმ Tris (pH 8.0 20 ଌ ტემპერატურაზე), 1 მმ EDTA, 50 მმ KCl, 20 μM cAMP. ელექტროფორეზი ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე 5% w/v პოლიაქრილამიდის გელში 45 მმ Tris-borate (pH 8.0), 2 mM EDTA, 20 μM cAMP. სიმბოლოები: F, თავისუფალი დნმ C1, გ2 და გ3, კომპლექსები 1, 2 და 3 CAP დიმერებით შეკრული დნმ -ის მოლეკულაზე, შესაბამისად C1რ, გ2R და C3R, კომპლექსები ერთი რეპრესორული ტეტრამერით და 1, 2 და 3 CAP დიმერებით შეკრული დნმ -ის მოლეკულაზე, შესაბამისად.


გელის ქვემენიუ

აქ არის ის, რაც თქვენ უნდა გააკეთოთ 1-D გელის გასაანალიზებლად:

  1. გამოიყენეთ მართკუთხა შერჩევის ინსტრუმენტი პირველი შესახვევის დასახატად. ეს უნდა იყოს მარცხენა ბილიკი, თუ ბილიკები არის ვერტიკალური ან ზედა ბილიკი, თუ ბილიკები ჰორიზონტალურია. გაითვალისწინეთ, რომ ბილიკები ითვლება ვერტიკალურად, თუ საწყისი შერჩევის სიგანე არანაკლებ ორჯერ აღემატება მის სიმაღლეს.
  2. აირჩიეთ გაანალიზეთ & gtGels & gt აირჩიეთ პირველი შესახვევი (ან დააჭირეთ & quot1 & quot) და ხაზი გამოჩნდება და & quotLane 1 არჩეული & quot გამოჩნდება სტატუსის ზოლში.
  3. გადაიტანეთ მართკუთხა შერჩევა მომდევნო ზოლზე (ან ქვემოთ თუ ბილიკები ჰორიზონტალურია) და აირჩიეთ გაანალიზეთ & gtGels & gt აირჩიეთ შემდეგი შესახვევი (ან დააჭირეთ & quot2 & quot). არჩეული ზოლი გამოკვეთილია და იარლიყით, ხოლო & quotLane n შერჩეული & quot ნაჩვენებია სტატუსის ზოლში.
  4. Repeat the previous step for each remaining lane.
  5. აირჩიეთ Analyze>Gels>Plot Lanes (or press "3") to generate the lane profile plots.
  6. Use the straight line selection tool to draw base lines and/or drop lines so that each peak of interest defines a closed area. To get to all the lanes, it may be necessary to scroll the image vertically using the "Hand" tool. (Hold down the space bar to temporarily switch to this tool).
  7. For each peak, measure the size by clicking inside with the wand tool. If necessary, scroll the image vertically by holding down the space bar and dragging.
  8. აირჩიეთ Analyze>Gels>Label Peaks to label each measured peak with its size as a percent of the total size of the measured peaks.

1 Answer 1

The are some things you need to be aware of when measuring intensity in imageJ:

  1. ImageJ automatically converts images to 8-bit
  2. You should ALWAYS use RAW if available
  3. If your microscope cannot save files as RAW format you must use .tif, other formats create artifacts
  4. Save channels separately not as an RGB stack if you are using .tif format

Before threshold you must split the channels, especially if you are looking for florescence from a certain wavelength.

You also need to use the "Watershed" function after the threshold so it will outline individual cells allowing you to avoid outlining a group of cells globed together. This way you can measure their individual intensities. However it is not perfect so once ROI pops up and the cells have been outlined by the particle analysis you must go through and ensure it is measuring singular cells. Any outlines containing more than one cell should be deleted. Also look for odd shaped cells or micro-nuclei, which should also be deleted.

Now I assume you are measuring human cancer cells. You should use these settings:

After all of this then you apply the overlay. Whatever image you are overlaying on you must also split the channels of that as well and use the channel that contains the wavelength you are measuring (ie: Alexaflour 488 would be in the GFP channel).

If you have been collecting data without doing this I would trash all of it as the procedure done to collect it hasn't controlled for anything.


Detection Systems

The detector is the device located at the end of the column which provides a quantitative measurement of the components of the mixture as they elute in combination with the carrier gas. In theory, any property of the gaseous mixture that is different from the carrier gas can be used as a detection method. These detection properties fall into two categories: bulk properties and specific properties. Bulk properties, which are also known as general properties, are properties that both the carrier gas and analyte possess but to different degrees. Specific properties, such as detectors that measure nitrogen-phosphorous content, have limited applications but compensate for this by their increased sensitivity.

Each detector has two main parts that when used together they serve as transducers to convert the detected property changes into an electrical signal that is recorded as a chromatogram. The first part of the detector is the sensor which is placed as close the the column exit as possible in order to optimize detection. The second is the electronic equipment used to digitize the analog signal so that a computer may analyze the acquired chromatogram. The sooner the analog signal is converted into a digital signal, the greater the signal-to-noise ratio becomes, as analog signal are easily susceptible to many types of interferences.

An ideal GC detector is distinguished by several characteristics. The first requirement is adequate sensitivity to provide a high resolution signal for all components in the mixture. This is clearly an idealized statement as such a sample would approach zero volume and the detector would need infinite sensitivity to detect it. In modern instruments, the sensitivities of the detectors are in the range of 10 -8 to 10 -15 g of solute per second. Furthermore, the quantity of sample must be reproducible and many columns will distort peaks if enough sample is not injected. An ideal column will also be chemically inert and and should not alter the sample in any way. Optimized columns will be able to withstand temperatures in the range of -200 °C to at least 400 °C. In addition, such a column would have a short linear response time that is independent of flow rate and extends for several orders of magnitude. Moreover, the detector should be reliable, predictable and easy to operate.

Understandably, it is not possible for a detector meet all of these requirements. The next subsections will discuss some of the more common types of gas chromatography detectors and the relative advantages and/or disadvantages of each.


Უყურე ვიდეოს: Ingeniería genética- Western blot (იანვარი 2022).