ინფორმაცია

ლუმინესცენციის გაზომვა ფლუორესცენციის ფირფიტის მკითხველში


ჩვენ ვიმსჯელებთ ლაბორატორიული მუშაობის ორგანიზებაზე ლუმინესცენციის რეპორტიორების დაკალიბრებაზე (მაგალითად, ლუციფერაზა) და ერთ – ერთი მთავარი კითხვა, რომელზეც პასუხი არ ვიცი, არის ის, შეუძლია თუ არა ფირფიტების მკითხველთა უმეტესობას გაზომოს ლუმინესცენცია.

პირველი პრინციპების თვალსაზრისით, ფლუორესცენციის ფირფიტების ნებისმიერ მკითხველს უნდა შეეძლოს ასევე გაზომოს ლუმინესცენცია - უბრალოდ არ ჩართოთ აღგზნების სინათლის წყარო. ამრიგად, მე ველოდი, რომ ტიპიური ფლუორესცენციის მკითხველს ასევე უნდა შეეძლოს ლუმინესცენციის გაზომვა.

მეორეს მხრივ, ინტერნეტში ძებნისას, მე ვარ ჩაძირული მწარმოებლების მიერ, რომელთაც სურთ მიყიდონ სპეციალიზირებული ლუმინესცენციის მკითხველები, რომლებიც ხაზს უსვამენ მათ მგრძნობელობას, რაც მაფიქრებინებს, რომ შესაძლოა ფლუორესცენციის ფირფიტების მკითხველებს არ შეეძლოთ ლუმინესცენციის გაზომვა.

მაშ, ჩემი შეკითხვა ასეთია: უნდა ველოდო, რომ ტიპიური მიმდინარე ფლუორესცენციის ფირფიტის მკითხველი ასევე შეძლებს ლუმინესცენციის გაზომვას, თუ ეს ბევრად უფრო სპეციალიზებული შესაძლებლობაა?


როგორც სხვა პასუხებშია ნათქვამი, ტექნიკურად ფირფიტების მკითხველებს, რომელთაც აქვთ ფლუორესცენტური გაზომვები, ასევე შეუძლიათ luminescent კითხვების გაკეთება, მაგრამ მგრძნობელობა შეიძლება იყოს დაბალი (https://www.biotek.com/resources/technical-notes/use-of-the -ფლუორესცენცია-ოპტიკა-გაზომვა-ლუმინესცენციური რეაქციები-მაღალი კარგად სიმკვრივის მიკროპლატებში-საზომი-ლუმინესცენცია-1536-ში-კარგად-მიკროპლატებზე/).

ის, რაც მე არ მინახავს ნახსენებია, არის პოტენციურად სხვა აპარატურის შეზღუდვა იმის მიხედვით, თუ რა ტიპის ლუმინესცენციას იყენებთ. ფართოდ არსებობს ორი ტიპი: ბრწყინვალება და კაშკაშა ლუმინესცენცია.

მბზინავი ლუმინესცენცია ალბათ ყველაზე მეტად ფლუორესცენციას ჰგავს იმით, რომ იგი თანდათანობით შენდება და შეიძლება დარჩეს სტაბილური გახანგრძლივებული პერიოდის განმავლობაში (იფიქრეთ იმაზე, რომ ნათურა ჩართულია და თბება). Flash luminescence, თუმცა, ბევრად უფრო გარდამავალია, როგორც სახელი შეიძლება ვარაუდობდეს. რეაქციები, რომლებიც იწვევენ მოციმციმე ლუმინესცენციას, წარმოქმნიან სინათლის ხანმოკლე აფეთქებას (რომელიც შეიძლება გაგრძელდეს წამებიდან წუთებამდე), რომელიც, როგორც წესი, უფრო კაშკაშაა, ვიდრე ის, რაც წარმოიქმნება მბზინვარე ლუმინესცენციის შედეგად. (https://www.bmglabtech.com/what-is-the-difference-bet-flash-and-glow-luminescence-assays/)

ვინაიდან ზოგიერთი გამანათებელი ნათურა მხოლოდ სიგნალს გამოიმუშავებს რეაგენტის დამატებიდან რამდენიმე წამში, მნიშვნელოვანია დაუყოვნებლივ გაზომვა, რაც შეიძლება გაკეთდეს ფირფიტის წამკითხველში ავტოინექტორების გამოყენებით. (https://www.biotek.com/products/detection-flash-luminescence-technology.html) ეს შეიძლება იყოს ან არ იყოს ჩართული ფირფიტების წამკითხველში, რომელიც ეძღვნება ფლუორესცენტურ კითხვას.

ასე რომ, შეჯამება, მიუხედავად იმისა, რომ ლუმინესცენციის გაზომვა შესაძლებელია ფირფიტების მკითხველის მიერ, რომელსაც შეუძლია ფლუორესცენციის გაზომვა, მგრძნობელობა შეიძლება იყოს ძალიან დაბალი. გარდა ამისა, დამატებითი ტექნიკური მოთხოვნები, როგორიცაა ავტოინექტორი, შეიძლება საჭირო იყოს გარკვეული luminescence ანალიზებისთვის.


მე ვარ რენე ინკმანი და ვარ დოქტორანტი მაქს პლანკის ინსტიტუტში მარბურგში, გერმანია. დოქტორანტურაში მე რეგულარულად ვიყენებ ლუმინესცენციას და მე ასევე ვიყავი პასუხისმგებელი ჩვენი ზოგიერთი შემმუშავებლის ორგანიზებაზე.

ამიტომ შემიძლია გითხრათ, რომ თქვენ გჭირდებათ Platereader, რომელსაც შეუძლია გაზომოს luminescence და თქვენ არ შეგიძლიათ უბრალოდ მიიღოს fluorescence platereader. ლუმინესცენციისა და ფლუორესცენციის გაზომვის აპარატურა განსხვავებულია.

თუმცა ამ დღეებში ბევრი Platereader მოდელს უკვე გააჩნია ტექნიკის ორივე ვარიანტი, რაც იმას ნიშნავს, რომ თქვენ შეგიძლიათ გაზომოთ ლუმინესცენცია და ფლუორესცენცია ერთსა და იმავე მოწყობილობაში. თქვენ უბრალოდ უნდა შეამოწმოთ თქვენი ფირფიტის მოდელი, თუ მას შეუძლია გაზომოს ლუმინესცენცია. ასე რომ თქვენ არ გჭირდებათ ცალკე ფირფიტა მხოლოდ ლუმინესცენციისთვის, არამედ გჭირდებათ ის, რომელსაც აქვს დამონტაჟებული სანათურის დამატება.

რაც შეეხება თქვენს იდეას ლუმინესცენციის ნორმალიზების შესახებ, მე ასევე მაქვს დიდი ინტერესი ამით და ჩვენ უკვე დავიწყეთ ამაზე მუშაობა. იქნებ ჩვენ შევძლოთ იდეების გაცვლა რაღაც მომენტში?


ანეკდოტურად, ყველა ფლუორესცენციის მქონე ფირფიტის მკითხველი, რომელიც მე გამოვიყენე, ასევე იყო ლუმინესცენციის უნარი (BMG და Tecan მოდელები).

თუ ლუმინესცენციის მქონე ფირფიტების მკითხველზე წვდომა შეზღუდულია, ჩვენ ასევე შევძელით ლუმინესცენციის გაზომვა GelDoc– ის გამოყენებით, რომელიც განკუთვნილია ელექტროფორეზის გელების გამოსახვისათვის. ეს შეიძლება იყოს რაღაც შესასწავლი, რადგან მე ვფიქრობ, რომ გელის გამოსახულები უფრო ფართოდ გავრცელებულია, ვიდრე ფირფიტის მკითხველები.


აპრიორი რასაც თქვენ ამბობთ ფლუორესცენციისა და ლუმინესცენციის მკითხველების შესახებ სწორია, ვიკიპედიაც კი ამას პირდაპირ აცხადებს:

ლუმინესცენციის გამოვლენა ოპტიკურად უფრო ადვილია ვიდრე ფლუორესცენციის გამოვლენა, რადგან ლუმინესცენცია არ საჭიროებს სინათლის წყაროს აღგზნებისთვის ან ოპტიკას დისკრეტული აღგზნების ტალღების სიგრძის შესარჩევად.

ამასთან, ღირს ფლუორესცენციისა და ლუმინესცენციის მოწყობილობების შედარება მგრძნობელობისა და გაჯერების ბარიერი. შესაძლებელია, რომ ლუმინესცენციის მოწყობილობა, რომელიც შექმნილია ლუმინესცენციის ძალიან სუსტი დონის გამოვლენის მიზნით, ბრმა (ანუ გაჯერებული) იყოს უფრო ძლიერი შუქით. რაც უფრო მნიშვნელოვანია თქვენს შემთხვევაში, ფლუორესცენციის მოწყობილობის დეტექტორები შეიძლება იყოს არასაკმარისად მგრძნობიარე ლუმინესცენციის შესწავლის პრაქტიკული მიზნებისათვის.

და მაინც, უმჯობესია, კონსულტაციები გაუწიოთ ნამდვილ ექსპერტს, სანამ ახალ მოწყობილობაზე ფულს დახარჯავთ.


ზედა კითხვა ჩვეულებრივ იძლევა სიგნალ-ხმაურის უკეთეს თანაფარდობას ხსნარებზე დაფუძნებული ანალიზებისთვის, როგორიცაა დნმ-ის კვანტიფიკაცია ან ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრა. ზოგადად, ფლუორესცენციის კითხვა ზემოდან უფრო მგრძნობიარეა, ვიდრე ქვემოდან. ეს არის სინათლის შესუსტება და გაფანტვა ჭაბურღილის პლასტმასის საშუალებით, რამაც შეიძლება გაზარდოს ფონი და შეამციროს გაზომვის ეფექტურობა. ამრიგად, ქვედა გამჭვირვალე პლასტმასის ხარისხი და სისქე და ფლუოროფორის ტიპი მნიშვნელოვანია გასათვალისწინებელი თქვენი ანალიზის შემუშავებისას.


ფლუორესცენტური ფირფიტების მკითხველი

ბიომოლეკულური ანალიზის საშუალებას აქვს მოლეკულური მოწყობილობები SPECTRAmax Gemini EM ფლუორესცენტური ფირფიტების მკითხველი. ინსტრუმენტი მდებარეობს პინ ჰოლის ოთახში 1074, ბიომოლეკულური ანალიზის დაწესებულებაში. მომხმარებლებმა უნდა დაუკავშირდნენ ბიომოლეკულური ანალიზის დაწესებულების დოქტორ ჯონ შენონს 434.243.9399 ან ელექტრონული ფოსტით [email protected] ანგარიშის შესაქმნელად კომპიუტერზე, რომელიც აკონტროლებს ინსტრუმენტს. დოქტორი შენონი შესთავაზებს ძირითად სწავლებას ინსტრუმენტის მუშაობისათვის. დაწყების ინსტრუქციები ხელმისაწვდომია. მომხმარებელთა უმეტესობას მხოლოდ მოკლე დრო სჭირდება კითხვის დასასრულებლად, ამიტომ უჩვეულოა ინსტრუმენტის გამოყენების ლოდინი, ამიტომ სტანდარტული გამოყენებისათვის დაჯავშნა არ არის საჭირო.

ზოგიერთი განაცხადი ინსტრუმენტზე არის

  • ცოცხალი და მკვდარი უჯრედების გაზომვა ერთ ჭაბურღილში, Promega MultiTox რეაგენტების გამოყენებით ცოცხალი და მკვდარი უჯრედებისათვის სპეციფიური პროტეინაზების გასაზომად. ეს ანალიზი იყენებს ინსტრუმენტის შესაძლებლობას, გაზომოს ორი ფლუოროფორი იმავე ანალიზში და ჭაბურღილების სკანირება მოახდინოს უჯრედების კვანძების მოსაძებნად.
  • კულტივირებული უჯრედების გლიკოგენის შემცველობის გაზომვა
  • დნმ -ის და რნმ -ის რაოდენობრივი განსაზღვრა PicoGreen- ით ან სხვა საღებავებით
  • კათეფსინის ანალიზი
  • ფარდობითი უჯრედების რიცხვის გაზომვა ალამარ ცისფერით
  • უჯრედშიდა კალციუმი
  • მგრძნობიარე ცილის შეფასება
  • ქოლესტერინის ანალიზი
  • ერთი მომხმარებელი ადგენს დნმ -ს რაოდენობას 5 ნგ/მლ -ზე.

SPECTRAmax ინსტრუმენტის მახასიათებლებია

  • ორმაგი მონოქრომატორები (გამტარობა 9 ნმ), რაც საშუალებას იძლევა ნებისმიერი ფლუოროფორის წაკითხვა 250 -დან 850 ნმ -ის ფარგლებში
  • ფლუორესცენტური სპექტრის უნარი
  • ფირფიტების ზედა ან ქვედა კითხვა უჯრედებისათვის
  • კარგად სკანირება
  • კინეტიკური გაზომვები
  • 384, 96, 48, 24, 12, 6 ჭაბურღილის ფირფიტები
  • ფირფიტების გათბობა
  • ფირფიტის შერყევა
  • SoftMax Pro 4.7 პროგრამული უზრუნველყოფა მონაცემთა ანალიზისთვის.
  • 3 მმოლ/ჭაბურღილის FITC მგრძნობელობა ყველაზე მაღალი მაჩვენებლით

ეს ინსტრუმენტი არ ზომავს შეწოვას.

მას შეუძლია შეასრულოს გარკვეული დროის განმავლობაში გადაწყვეტილი ფლუორესცენციის გაზომვები, მაგრამ არა პოლარიზებული ფლუორესცენცია.

ინსტრუმენტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც ლუმინომეტრი ზოგიერთი პროგრამისთვის. მას არ გააჩნია გამოყოფილი ლუმინომეტრის მგრძნობელობა, ასევე არ აქვს ინჟექტორები, რომლებიც საჭიროა გამჭვირვალე ლუმინესცენციის ანალიზისათვის მაგ. Promega Dual Glo Luciferase ტესტები.
გამოვლენის ლიმიტი: 10 ამოლი/ჭაბურღილის ტუტე ფოსფატაზა 200 μL/ჭაბურღილი (მიღებული Emerald II TM რეაგენტით Applied Biosystems– დან).

ინსტრუმენტი მუშაობს მომხმარებლის მიერ. გამოყენების ამჟამინდელი გადასახადი არის $ 15 პირველი 10 წუთის განმავლობაში, $ 15/სთ პირველი 10 წუთის შემდეგ.

ფლუორესცენციისათვის, ყველა შავი ფირფიტა რეკომენდირებულია ლუმინესცენციისთვის, თეთრი ფირფიტები, რომლებიც სინათლისგან დაცული უნდა იყოს, რათა შეამციროს სინათლის ემისია პლასტმასისგან.


ფირფიტის მკითხველის გაცნობა

ბევრი ბიოლოგიური ანალიზი იყენებს ბიოლუმინესცენციურ, ფლუორესცენტულ ან კოლორიმეტრულ რეაქციებს სიგნალის შესაქმნელად, რომელიც უნდა შეფასდეს ექსპერიმენტის შედეგის ინტერპრეტაციისთვის.

ლუმინესცენციისა და ფლუორესცენციის სიგნალები გამოვლენილი და რაოდენობრივია შესაბამისად ლუმინომეტრებისა და ფლუორომეტრების გამოყენებით, ხოლო კოლომეტრიული და შთამნთქმელი გაზომვები გამოვლენილია სინათლის შთანთქმით კონკრეტული ტალღის სიგრძეზე. თუ ანალიზი ტარდება მიკროცირკულაციის ფირფიტაში, ამ ანალიზებიდან გამოსული სინათლე იზომება მიკრო ფირფიტების მკითხველის (ან ფირფიტის მკითხველის) გამოყენებით.

ლუმინომეტრები და ფლუორომეტრები მერყეობს მარტივი, ხელის მოწყობილობიდან დაწყებული დახვეწილი მიკრო ფირფიტების მკითხველამდე, რომლებიც შეიძლება ინტეგრირებული იყოს მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის ანალიზის ავტომატიზირებულ სისტემებთან.

ლუმინესცენციის, ფლუორესცენციის ან შთანთქმის გამოვლენის სისტემის არჩევის ძირითადი მახასიათებლები მოიცავს გამტარუნარიანობის საჭიროებებს (რამდენ ანალიზს გაატარებ?), მოქნილობა (რა ტიპის ანალიზებს გაატარებ?), პორტაბელურობა (სად გამოიყენებ ინსტრუმენტს? ) და გამოყენების სიმარტივე (რამდენი მომზადება და ტრენინგია საჭირო?).

რაოდენობის და ტიპის ანალიზების გათვალისწინებით, რომლის განხორციელებასაც გეგმავთ, განისაზღვრება თქვენთვის საჭირო გამოვლენის მეთოდები და გამტარუნარიანობა და დააკმაყოფილებს თუ არა თქვენს საჭიროებებს გამოყოფილი ლუმინომეტრი, მულტიმოდ მკითხველი ან უბრალო ფლუორომეტრი. თუ თქვენ ფიქრობთ, რომ თქვენი მოთხოვნილებები დროთა განმავლობაში შეიცვლება, ფირფიტის მკითხველები, რომლებიც გვთავაზობენ მოდულურ ფორმატებს, რაც მომავალში შესაძლებელს გახდის ანალიზების უფრო ფართო სპექტრს, არის კარგი არჩევანი.


ფირფიტის წინადადებები

თუ თქვენ ეძებთ კონკრეტულ ფირფიტებს გამოსაყენებლად, 96 ჭაბურღილის ფირფიტების წინადადებები ჩამოთვლილია ქვემოთ:

თეთრი ფირფიტები, მყარი ქვედა

თეთრი ფირფიტები, წმინდა ქვედა

შავი ფირფიტები, მყარი ქვედა

  • Corning® Costar ფირფიტა (კატა.# 3916)
  • Greiner Bio-One CELLSTAR ფირფიტა (კატა.# 655079)
  • Nunc ™ F96 MicroWell ™ Plate (კატა.# 137101)

შავი ფირფიტები, წმინდა ქვედა

გჭირდებათ Microplate Reader?

Costar არის რეგისტრირებული სასაქონლო ნიშანი Corning, Inc. MicroWell და Nunc არის Nalge Nunc International– ის სასაქონლო ნიშნები. Optilux არის Becton, Dickinson and Company– ის სავაჭრო ნიშანი.

პროდუქტები შეიძლება დაფარული იყოს მომლოდინე ან გაცემული პატენტებით ან შეიძლება ჰქონდეს გარკვეული შეზღუდვები. გთხოვთ ეწვიოთ ჩვენს ვებ გვერდს დამატებითი ინფორმაციისთვის.


BioTek Fluorescence Microplate Reader გამოყენება ქიმილუმინესცენციის გამოვლენისათვის

ქიმილუმინესცენცია არის უაღრესად მგრძნობიარე ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება ბიოლოგიურ მეცნიერებებში ფართო სპექტრში. აქ ჩვენ აღწერს გამოყენების FL600 Fluorescence Microplate Reader for & quotglow & quot chemiluminescent განსაზღვრისათვის.

შესავალი

მოლეკულები, რომლებიც ათავისუფლებენ შუქს, ამას აკეთებენ მაღალი ენერგიის მდგომარეობაში ყოფნის შედეგად, რომელსაც ხშირად მოიხსენიებენ როგორც "quotexcited state" და შემდეგ უბრუნდებიან უფრო დაბალ ენერგიას ან საწყის მდგომარეობას ენერგიის შემდგომი გამოთავისუფლებით (სურათი 1). აღგზნებული მოლეკულებისგან შუქის წარმოება, როგორც ჭარბი ენერგიის განთავისუფლების საშუალება, უჩვეულოა. ფლუორესცენციის შემთხვევაში აღგზნებული მდგომარეობის მისაღწევად საჭირო ენერგია უზრუნველყოფილია სინათლის კონკრეტული ტალღის სიგრძით განათებით. ქიმილიუმინესცენცია, მეორეს მხრივ, არ მოითხოვს ეგზოგენური შუქის შეყვანას, არამედ იყენებს სპეციფიკურ ქიმიურ რეაქციებში შემავალ ენერგიას საჭირო ენერგიის უზრუნველსაყოფად. ძალიან მცირე გამონაკლისის გარდა, ორგანული ნაერთების ეფექტური ქიმილუმინესცენცია არის დაჟანგვის შედეგი (1), მაგრამ ასევე შემუშავებულია სპეციალიზირებული & quothigh ენერგია & ჟანგბადით მდიდარი ნაერთები, რომლებიც დანაწევრებისას იშლება (2).

ფერმენტი ტუტე ფოსფატაზა კატალიზირებს ფოსფატის ნაწილების ჰიდროლიზს სხვადასხვა მოლეკულისგან. ტუტე ფოსფატაზას ფერმენტის აქტივობის რაოდენობა ჩვეულებრივ საჭიროა, როდესაც ტუტე ფოსფატაზა შეუერთდა ანტისხეულებს, როგორც იმუნოდეტექციის სისტემის ნაწილი. რაც შეეხება ტუტე ფოსფატაზას გაზომვას, შემუშავებულია რამდენიმე განსხვავებული სუბსტრატი, რომელიც იძლევა პროდუქტის უშუალო გაზომვის საშუალებას. მაგალითად, ჰიდროლიზი გვტუტე ფოსფატაზას მიერ ნიტროფენილ ფოსფატი (pnpp) იწვევს ფერადი ნაერთის წარმოქმნას, რომელიც შთანთქავს შუქს მაქსიმალურად 405 ნმ (3). ანალოგიურად, ტუტე ფოსფატაზას მოქმედება მეთილუმბელიფერონის ფოსფატზე (MUP) იწვევს მეთილუმბელიფერონის წარმოქმნას, რომელიც შეიძლება გამოვლინდეს მისი ფლუორესცენციით (4). უფრო მგრძნობიარობის მისაღწევად შეიქმნა სუბსტრატები, რომლებიც ასხივებენ შუქს (ლუმინესს) ტუტე ფოსფატაზას მოქმედების შემდეგ.

სურათი 1. სქემატური დიაგრამა, რომელიც ასახავს სინათლის წარმოქმნას მბზინავი მოლეკულებისგან აღგზნებულ მდგომარეობაში. გაითვალისწინეთ, რომ ძირითადი მდგომარეობის მოლეკულის დესტაბილიზაცია ან დაჟანგვა შეიძლება თან ახლდეს ძირეული მდგომარეობიდან აღგზნებულ მდგომარეობას.

ნაერთების ერთი ჯგუფი, რომელიც ასხივებს სინათლეს, არის 1,2-დიოქსეტანი. როგორც ნაჩვენებია სურათზე 2, როდესაც 1,2-დიოქსეტანის ნაერთი CSPD დეფოსფორილირდება ტუტე ფოსფატაზით, წარმოიქმნება არასტაბილური შუალედური ანიონი.

სურათი 2. სუბსტრატის ქიმიური რეაქცია (AMPPD) და ტუტე ფოსფატაზა იძლევა პროდუქტებს, რომლებიც იშლება და საბოლოოდ გამოსცემს სინათლეს. 1,2 დიოქსეტანის სტრუქტურა, რომელსაც შეუძლია იმოქმედოს როგორც სუბსტრატი რამდენიმე სხვადასხვა ფერმენტისთვის, სპეციფიურობისთვის მიმაგრებული გვერდითი ჯგუფების მიხედვით. ფერმენტის მიუხედავად, სტაბილიზაციის გვერდითი ჯგუფის მოცილების შემდეგ, ნაერთი იშლება არასტაბილურ შუალედურ ნაწილებად და ნაბიჯების სერიის შემდეგ საბოლოოდ გამოსცემს შუქს.

ეს შუალედი შემდგომში იშლება, კარბონილის ნაერთად, რომელიც საბოლოოდ ათავისუფლებს მის ენერგიას 466 ნმ სინათლის სახით. ვინაიდან შუალედური ანიონი ნელ-ნელა და ფიქსირებული სიჩქარით იშლება, ორსაფეხურიანი პროცესი იძლევა სტაბილური ქიმიური განათების შესაძლებლობას, რომელიც დამოკიდებულია ტუტე ფოსფატაზის კონცენტრაციაზე.

სხვა ფერმენტული აქტივობების გაზომვა შესაძლებელია იგივე ძირითადი 1,2 დიოქსეტანის სტრუქტურით. მაგალითად, სუბსტრატს, რომელიც გამოიყენება სზლიგ-გალაქტოზიდაზას განსაზღვრისათვის, აქვს იგივე 1,2 დიოქსეტანის ნაერთის სტრუქტურა, მაგრამ აქვს გალაქტოზის ნაწილი, რომელიც შეიცვალა ფოსფატის ჯგუფით, რომელიც ნაჩვენებია ნახატ 2-ში. , რის შედეგადაც გამოდის სინათლე.

ქიმიურმუმინესცენციური სიგნალი შეიძლება კიდევ უფრო გაიზარდოს მაკრომოლეკულური გამაძლიერებლების დამატებით. წყლის გარემო ამცირებს ქიმილუმინესცენციურ სიგნალს წყლით გამოწვეული ჩაქრობის გზით. მაკრომოლეკულური გამაძლიერებლები გამორიცხავენ წყალს ქიმილიუმინესცენციის წარმოების ადგილიდან, რითაც ზრდის ემისიების ეფექტურობას. საინტერესოა, რომ ბევრი გამაძლიერებელი შეცვლის გამომუშავებული შუქის ემისიის მახასიათებლებს.

ამ განაცხადის ჩანაწერში ჩვენ აღწერს FL600 ფლუორესცენციის მიკროპლატის მკითხველის გამოყენებას 1,2 დიოქსეტანის სუბსტრატებთან ერთად ბრწყინვალე ტიპის ქიმილუმინესცენციის დასადგენად გამაძლიერებლებთან ერთად.

Მასალა და მეთოდები

ტუტე ფოსფატაზა (კატალოგის ნომერი P-5521) და & szlig-galactosidase (კატალოგის ნომერი G-3153) იყო Sigma Chemical Company (St. Louis MO). CSPD TM, Galacton-Star TM და Sapphire II TM გამაძლიერებელი შეიძინა Tropix– დან (Bedford, Mass.). გაუმჭვირვალე თეთრი მიკრო ფირფიტები (კატალოგის ნომერი 3912) იქნა მიღებული კოსტარისგან (კემბრიჯი, მასა.).

ტუტე ფოსფატაზას ანალიზი ჩატარდა შემდეგნაირად. განზავების სერია, დაწყებული 0,0 -დან 2000 ნგ/მლ -მდე ხბოს ნაწლავის ტუტე ფოსფატაზით, გაკეთდა ტუტე ფოსფატაზას ანალიზის ბუფერის გამოყენებით, როგორც გამხსნელი. ტუტე ფოსფატაზას ანალიზის ბუფერი შედგებოდა 1 მმ MgCl2, 100 მმ DEA pH 9.0 დიონიზირებულ წყალში. განზავების შემდეგ, ნიმუშებისა და სტანდარტების 10 და მიკროლოვანი ნაწილები მიედინება მიკროპლატის ჭაბურღილში ოთხჯერ.

სუბსტრატის გამაძლიერებელი ნარევი ახალი მომზადდა კონცენტრირებული Sapphire II TM გამაძლიერებლის 1:10 განზავებით ანალიზის ბუფერთან ერთად, შემდეგ დაამატეთ 17 & მიკროლი კონცენტრირებული CSPD სუბსტრატის ხსნარი თითოეულ 1.0 მლ განზავებულ გამაძლიერებელ ნარევს, რის შედეგადაც სუბსტრატის საბოლოო კონცენტრაცია 0.4 მმ. რეაქციები შემდეგ დაიწყო 200 & მიკროლის გამაძლიერებელი-სუბსტრატის ნარევის დამატებით. რეაქციები შემდეგ ინკუბაცია ხდება გარემოს ტემპერატურაზე სხვადასხვა დროს, რაც დამოკიდებულია ფერმენტის საწყის კონცენტრაციაზე. ლუმინესცენციის დადგენა გაკეთდა FL600F ფლუორესცენციის მიკრო ფირფიტების მკითხველის გამოყენებით. მგრძნობელობის პარამეტრი იყო 150 და მონაცემები შეგროვებული ზემოდან 5 მმ ზონდით სტატიკური შერჩევის გამოყენებით 0.35 წამი დაგვიანებით, 50 კითხვა თითო ჭაბურღილზე. ნათურა გამორთულია და ემისიის ფილტრი ამოღებულია.

& შლიგ-გალაქტოზიდაზას ანალიზები ჩატარდა შემდეგნაირად. განზავების სერია დაწყებული 0.0-დან 500-მდე და მიკროგ/მლ & szlig-galactosidase ფერმენტის შემქმნელი იყო & szlig-gal ანალიზის ბუფერი, როგორც გამხსნელი. & szlig-Gal ანალიზის ბუფერი შედგებოდა 100 მმ ნატრიუმის ფოსფატის pH 7.5 დეიონიზირებულ წყალში. განზავების შემდეგ, ნიმუშებისა და სტანდარტების 10 და მიკროლოვანი ნაწილები მიედინება მიკროპლატის ჭაბურღილში ოთხჯერ. გამაძლიერებელი-სუბსტრატის ნარევი გაკეთდა კონცენტრირებული Sapphire II tm გამაძლიერებლის 1:10 განზავებით B-gal ანალიზის ბუფერთან ერთად. კონცენტრირებული გალაქტონის ვარსკვლავის tm სუბსტრატის ხსნარი დაემატა 0,1 მმ-ის საბოლოო სუბსტრატის კონცენტრაციას. რეაქციები შემდეგ დაიწყო გამაძლიერებელი-სუბსტრატის ნარევის 200 & მიკროლის დამატებით. რეაქციები ინკუბირებულია 37 ° C- ზე, სხვადასხვა დროს, დამოკიდებულია ფერმენტის საწყის კონცენტრაციაზე. ლუმინესცენციის დადგენა გაკეთდა FL600FA ფლუორესცენციის მიკრო ფირფიტების მკითხველის გამოყენებით. მგრძნობელობის პარამეტრი იყო 100 ან 150 და მონაცემები შეგროვებული ზემოდან 3 მმ ზონდით სტატიკური შერჩევის გამოყენებით 0.35 წამი დაგვიანებით, 50 კითხვა თითო ჭაბურღილზე. ნათურა გამორთულია და ემისიის ფილტრი ამოღებულია.

შედეგები

ინკუბაციის შესაბამისი ინტერვალების მნიშვნელობა ნაჩვენებია ნახაზზე 3. როდესაც ტუტე ფოსფატაზის რეაქციის ლუმინესცენცია კინეტიკურად იზომება, ლუმინესცენციის საწყისი ზრდა, რომელიც პიკს აღწევს და საბოლოოდ იკლებს. ეს ზრდა ყველაზე აშკარა და საკმაოდ სწრაფია ფერმენტების მაღალი კონცენტრაციით, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ ლუმინესცენციის ვარდნა არის ფერმენტის მიერ სუბსტრატის მოხმარების შედეგი. ინკუბაციის დრო, რომელიც განსაზღვრავს პიკს ადრე აუცილებელია ხაზოვანიობის მისაღწევად.

სურათი 3. ლუმინესცენციის ცვლილება დროთა განმავლობაში. ტუტე ფოსფატაზის რეაქციების ლუმინესცენციის განსაზღვრა (5 x 10 -2 DEA ერთეული/ჭაბურღილი) კეთდებოდა კინეტიკურად ყოველ 2 წუთში 30 წუთის განმავლობაში. რეაქციები მომზადდა როგორც აღწერილია მასალებსა და მეთოდებში.

ფიგურა 4 აჩვენებს ინკუბაციის დროის მნიშვნელობას სასარგებლო კალიბრაციის მრუდის მოპოვებაში. როდესაც ეჭვმიტანილია, რომ უცნობი კონცენტრაციები საკმაოდ დაბალია, მაშინ შემოთავაზებულია უფრო გრძელი ინკუბაციის პერიოდი 30-40 წუთი, რაც საშუალებას მისცემს ფერმენტის აქტივობას გამოიმუშაოს მბზინავი პროდუქტის რაოდენობა, რომლის გაზომვაც შესაძლებელია, ხოლო ძალიან მაღალი ფერმენტის კონცენტრაცია მოითხოვს ინკუბაციის დროს 2 წუთი ან ნაკლები. ჩვენს ხელშია ინკუბაციის დრო 10-15 წუთი, რომელიც უზრუნველყოფდა ხაზოვანიობის ფართო სპექტრს. 10 წუთის ინკუბაციით, ფერმენტის განზავება მასშტაბის 5 ორდენზე მეტი აღმოჩნდა წრფივი. როგორც უკვე აღვნიშნეთ, გაზრდილი მგრძნობელობა მიიღეს უფრო ხანგრძლივმა ინკუბაციებმა, მაგრამ იმის ხარჯზე, რომ შევძლოთ უფრო მაღალი კონცენტრაციის განსაზღვრა.

მგრძნობელობის თვალსაზრისით, 30 წუთიანი ინკუბაციის დრო დაუშვა 25 მგ/მლ (p = 0.005) ტუტე ფოსფატაზის გამოვლენისათვის. ჭაბურღილში (10 & მიკროლი) ნიმუშის მოცულობის გათვალისწინებით, გამოვლენის ლიმიტი წარმოადგენს ჭაბურღილში ტუტე ფოსფატაზას 2,5 ატომოლის განსაზღვრას.

& szlig-Galactosidase ფერმენტის აქტივობა დადგინდა Galacton-Star tm სუბსტრატის გამოყენებით. CSPD tm სუბსტრატის მსგავსად, რომელიც გამოიყენება ტუტე ფოსფატაზის განსაზღვრისათვის, ლუმინესცენცია იზრდება ხაზოვანი გზით ფერმენტის რაოდენობის გაზრდით (სურათი 5). 5-წუთიანი ინკუბაციის გამოყენებით დაფიქსირდა სიდიდის ოთხი ორდენის წრფივი დიაპაზონი. როდესაც რეაქცია ინკუბირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში, აღინიშნება წრფივი კავშირი & შლიგ-გალაქტოზიდაზას კონცენტრაციებთან 0-დან 62.5-მდე და მიკროგ/მლ (სურათი 6). როგორც ტუტე ფოსფატაზას განსაზღვრისას, ფერმენტის მაღალი კონცენტრაცია ზოგადად მოითხოვს უფრო მოკლე ინკუბაციის დროს, ხოლო ძალიან დაბალი ფერმენტის კონცენტრაცია ბუნებრივად მოითხოვს უფრო ხანგრძლივ ინკუბაციას (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). მგრძნობელობის თვალსაზრისით, & szlig-galactosidase კონცენტრაცია 0.01 & მიკროგ/მლ (p = 0.03) შეიძლება გამოვლინდეს 30 წუთის ინკუბაციის გამოყენებით. ჭაბურღილში მოთავსებული მოცულობის გათვალისწინებით, ეს წარმოადგენს 100 pg & szlig-galactosidase ფერმენტის გამოვლენის შესაძლებლობას.

დისკუსია

ეს განაცხადის შენიშვნა აჩვენებს FL600 ფლუორესცენციის მიკროპლატის მკითხველის შესაძლებლობას განახორციელოს ბრწყინვალე ტიპის ქიმილუმინესცენციური განსაზღვრებები. მიუხედავად იმისა, რომ სპეციალურად არ არის შემუშავებული ამ პროგრამისთვის, FL600 აღგზნებით გამორთულია და გამონაბოლქვის ფილტრი ამოღებულია უზრუნველყოფს იმავე ინსტრუმენტის პლატფორმას, როგორც სპეციფიკური ლუმინესცენციის მიკრო ფირფიტების მკითხველი.

ნებისმიერი ექსპერიმენტის მსგავსად, რეაქციის ოპტიმიზაცია იძლევა საუკეთესო შედეგებს. 1,2 დიოქსეტანის ქიმილუმინესცენციის შემთხვევაში, სწორი ინკუბაციის დრო მნიშვნელოვანია ხაზოვანი შედეგებისთვის. ფერმენტის მაღალი კონცენტრაცია, რომელიც სუბსტრატს სწრაფად მოიხმარს, მოითხოვს ძალიან მოკლე ინკუბაციის დროს, ხოლო ფერმენტის დაბალ კონცენტრაციას აქვს უკეთესი სიგნალი ცარიელ თანაფარდობაზე, თუ უფრო ხანგრძლივია ინკუბაციის დრო.

ფლუორესცენციისგან განსხვავებით, რომელიც მოითხოვს სინათლის შეყვანას ტალღის კონკრეტულ ტალღის სიგრძეზე ემისიისთვის, ქიმილუმინესცენცია არ საჭიროებს სინათლის წყაროს ნიმუშს სინათლის გამოსხივებისათვის. ამრიგად, დეტექტორის ადგილმდებარეობის მიმდებარე ჭაბურღილებს შეუძლიათ გამოსხივონ სინათლე და პოტენციურად გავლენა იქონიონ ჭაბურღილზე, რომელსაც დეტექტორი ზომავს. ეს ფენომენი, რომელსაც ხშირად უწოდებენ კროსსტალკს, შეიძლება იყოს პრობლემა ლუმინესცენციის განსაზღვრისას, თუ ძალიან ინტენსიური ქიმილუმინესცენციის რეაქციები თან ახლავს რეაქციებს გაცილებით ნაკლები ქიმილუმინესცენციით.

ქიმილიუმინესცენციისათვის 1,2 დიოქსეტანის სუბსტრატის გამოყენებისას, გამაძლიერებლების ერთდროული გამოყენება მნიშვნელოვანია ადექვატური სიგნალის უზრუნველსაყოფად. მაკრომოლეკულური გამაძლიერებლები უზრუნველყოფენ არაწყლოვან გარემოს, რაც ზრდის სინათლის გამომუშავების ეფექტურობას წყლის გამოწვეული ჩაქრობის თავიდან ასაცილებლად. ეს გამაძლიერებლები ასევე ცვლის ემისიის ტალღის სიგრძის პიკს. მაგალითად Sapphire-II tm გამაძლიერებელი ცვლის ემისიის მაქსიმუმ 1,2-დიოქსეტანს 461nm– დან 475 nm– მდე, ხოლო გამაძლიერებელი Emerald-II tm გადაინაცვლებს მაქსიმუმ 542 nm– მდე. პროგრამის მიხედვით, სხვადასხვა გამაძლიერებლები უფრო შესაფერისია ვიდრე სხვები. რადგან Emerald-II TM უზრუნველყოფს უფრო დიდ აბსოლუტურ ინტენსივობას ვიდრე Sapphire-II TM მისი გამოსხივების პიკური ტალღის სიგრძეზე, ეს არის ოპტიმალური არჩევანი, თუ საჭიროა ძალიან დაბალი კონცენტრაცია ან სიგნალის მაქსიმალური ინტენსივობა. მეორეს მხრივ, Sapphire-II tm უზრუნველყოფს უფრო დიდ დინამიურ დიაპაზონს, ვინაიდან ფოტოდეტექტორი ნაკლებად არის გაჯერებული.

ამ განაცხადის ჩანაწერში ჩვენ აღწერილი გვაქვს FL600- ის გამოყენება ქიმილუმინესცენციის განსაზღვრისათვის. მიუხედავად იმისა, რომ 3 მმ დეტექტორის ზონდმა ძალიან კარგი შედეგი გამოიღო, ჩვენს ხელში 5 მმ დეტექტორის ზონდი ოდნავ აღემატებოდა გამოვლენის ლიმიტის შესრულებას. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ ვიყენებდით მხოლოდ თეთრი გაუმჭვირვალე მიკრო ფირფიტებს ზემოდან კითხვით, ქვედა ქვედა ფირფიტები ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ქვედა კითხვისთვის. ჯერ კიდევ რეკომენდირებულია გაუმჭვირვალე გვერდების გამოყენება. წაკითხვის რეჟიმის მიუხედავად, მხოლოდ კაშკაშა ტიპის ქიმილუმინესცენციური რეაქციებია შესაბამისი FL600– ით გაზომვისათვის. ციმციმის რეაქციები წარმოიქმნება სუბსტრატის დამატებიდან რამდენიმე წამში, რომელიც მოითხოვს ფლუიდის ინჟექტორს, რომელიც მდებარეობს ინსტრუმენტში. მბზინავი ტიპის რეაქციები, ხდება ბევრად უფრო ნელი ტემპით, რაც მომხმარებელს აძლევს საშუალებას დაამატოთ რეაგენტები მიკრო ფირფიტებზე და დაიწყოს ლუმინესცენციის განსაზღვრება რეაქციების დასრულებამდე.

ცნობები

(1) ვან დიიკი, კ. ედ. (1985) ბიოლუმინესცენცია და ქიმილუმინესცენცია: ინსტრუმენტები და პროგრამები ტ. 1, CRC Press, Inc. ბოკა რატონი, ფლორიდა.

(2) ვან დიიკი, კ და რ ვან დიიკ ედსი. (1990) Luminescence Immunoassay and Molecular Applications, CRC Press, Boston, Massachusetts.

(3) Crowther, J. (1995) ELISA Theory and Practice, Humana Press, ტოტოვა, ნიუ ჯერსი.

(4) ჰაუგლენდი, რ. (1996) სახელმძღვანელო ფლუორესცენტური ზონდების და კვლევითი ქიმიკატების მე -6 გამოცემა, Molecular Probes Inc., ევგენი, ორეგონი.

(5) ვან დიიკი, კ. ედ. (1985) ბიოლუმინესცენცია და ქიმილუმინესცენცია: ინსტრუმენტები და პროგრამები ტ. 2, CRC Press, Inc. ბოკა რატონი, ფლორიდა.


რა არის ორმაგი მონოქრომატული სპექტროფლუომეტრული სისტემა?

ზოგიერთი ფლუორესცენციის მიკროფრენის მკითხველი იყენებს ორმაგ მონოქრომატორებს ფილტრების ნაცვლად, რათა შეარჩიოს სინათლის ტალღის სიგრძე, რომელიც აღაგზნებს ნიმუშს, ასევე ტალღის სიგრძეს, რომელსაც ასხივებს ნიმუში. მონოქრომატორები იყენებენ დიფრაქციულ გრილს სინათლის ფერთა სივრცულად გამოსაყოფად და შეუძლიათ აირჩიონ ტალღის სიგრძის ფართო სპექტრი პროგრამის მიერ მოთხოვნილი თითოეული ტალღის სიგრძისთვის ცალკეული ფილტრის დაყენების გარეშე.

ჩვენი SpectraMax Gemini dual-monochromator spectrofluorometer იყენებს ორ სკანირების მონოქრომატორს ოპტიმალური აგზნების და გამოსხივების ტალღების სიგრძის შესარჩევად.


დნმ კვანტიფიკაცია Hoechst 33258 გამოყენებით

ფიჭური და მოლეკულური ბიოლოგიის აუცილებელი ელემენტია დნმ -ის რაოდენობრივი რაოდენობის განსაზღვრა დიდი რაოდენობით ნიმუშებში მგრძნობიარობით, რაც მცირე რაოდენობის ნიმუშის განსაზღვრის საშუალებას იძლევა. აქ ჩვენ აღვწერთ ფლუორესცენტურ მეთოდს დნმ -ის რაოდენობრივი გამოსათვლელად Hoechst 33258 საღებავით და BioTek FL600 ფლუორესცენციის მიკრო ფირფიტების მკითხველთან ერთად. ეს ანალიზი იძლევა წრფივ შედეგებს მასშტაბის სამ ორეულზე და შეუძლია რუტინულად აღმოაჩინოს დნმ -ის 8 ნგ. საღებავის კონცენტრაციის შემცირება აუმჯობესებს მგრძნობელობას 600 pg/ჭაბურღილამდე.

შესავალი

ფიჭური და მოლეკულური ბიოლოგიის მრავალი ტექნიკა მოითხოვს დსდმ რაოდენობის რაოდენობის განსაზღვრას დიდი რაოდენობით ნიმუშებში მგრძნობელობის დროს, რაც მთლიანი ნიმუშის მხოლოდ მცირე რაოდენობას მოითხოვს. მაგალითად, ციკლის თანმიმდევრობის რეაქციები მოითხოვს, რომ ბაქტერიული მინიპროპორციული დნმ -ის შესაბამისი კონცენტრაცია გამოყენებულ იქნას თანმიმდევრულად წარმატების მისაღწევად. მრავალი ბიოქიმიური კვლევა, რომელიც მოიცავს უჯრედული კულტურების ზრდის კინეტიკას ან უჯრედის ციკლის კვლევებს, მოითხოვს ნორმალიზებას დნმ -ის შემცველობით.

მიუხედავად იმისა, რომ დნმ -ის რაოდენობრივი განსაზღვრის მრავალი განსხვავებული მეთოდი არსებობს, მეთოდების უმეტესობას აქვს უარყოფითი მხარეები, რომლებიც გამორიცხავს მათ გამოყენებას მრავალ პროგრამაში. შთანთქმის გაზომვები 260 ნმ (A260) არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული მეთოდი დნმ -ის კონცენტრაციის განსაზღვრისათვის, მაგრამ ის განიცდის დამაბინძურებელი მოლეკულების ჩარევის შთანთქმას (1). ბევრი დამაბინძურებელი, რომელიც შეიცავს ნუკლეოტიდებს, რნმ -ს, EDTA- ს და ფენოლს, ჩვეულებრივ გვხვდება ნუკლეინის მჟავას პრეპარატებში. ფლუორესცენტური ბისბენზიმიდის (Hoechst) საღებავები გვერდს უვლის ამ პრობლემებს. Hoechst 33258 საღებავი შედარებით შერჩევითია dsDNA– სთვის და მაღალ მარილში არ აჩვენებს ფლუორესცენტულ გაძლიერებას ცილის ან რნმ – ის თანდასწრებით. საღებავი, სუსტად ფლუორესცენტული ხსნარში, კონკრეტულად უკავშირდება A-T ფუძე წყვილებს dsDNA– ში, რის შედეგადაც იზრდება ფლუორესცენცია და გადადის ემისიის მაქსიმუმი 500 – დან 460 ნმ – მდე (2, 3). Hoechst 33258- ის გამოყენება BioTek FL600 ფლუორესცენციის მიკროპლატის მკითხველთან ერთად გვთავაზობს მაღალ სპეციფიკას, ასევე მაღალ მგრძნობელობას dsDNA რაოდენობისათვის.

Მასალა და მეთოდები

ბისბენზიმიდი (Hoechst 33258), კატალოგის ნომერი B-2883, შეძენილია Sigma Chemical Co.- სგან (ქ. ლუი, მისური), ისევე როგორც ნატრიუმის ქლორიდი და ნატრიუმის მონობაზური ფოსფატი. 96 ჭაბურღილიანი შავი მიკრო დაფები გამჭვირვალე ქვედანით, კატალოგის ნომერი 3603, შეძენილია კოსტარისგან (კემბრიჯი, მასაჩუსეტსის შტატი). დაბალი ფლუორესცენტური ფონის შავი ბრტყელი ქვედა ფირფიტები, კატალოგის ნომერი 011-010-7805, მიღებული იყო Dynatech Laboratories, Inc.- დან (Chantilly, VA). ანალიზის ბუფერი (2M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 7.4) ადრე იყო მომზადებული და სტერილიზებული ავტოკლავირებით და შენახული 4 გრადუს ტემპერატურაზე. გამოყენებამდე ბუფერული ნაწილი ნებადართული იყო ოთახის ტემპერატურამდე გაათბო. Hoechst საღებავის მარაგი (1 მგ/მლ გამოხდილ H- ში2ო) ადრე იყო მომზადებული და სტერილიზებული ფილტრაციით 0.22 & მიკრომეტრის ფილტრის საშუალებით და ინახებოდა 4 გრადუს ტემპერატურაზე მსუბუქად მჭიდრო კონტეინერში. ანალიზის სამუშაო ხსნარი ყოველ ჯერზე მომზადდა ახალი შერევით 1 და მიკროლი კონცენტრირებული საღებავის ხსნარის შერევით ყოველ 1 მლ ანალიზის ბუფერზე, რაც მოითხოვს საბოლოო Hoechst 33258 კონცენტრაციას 1 და მიკროგ/მლ. Hoechst საღებავის საბოლოო კონცენტრაციების შემცველი 0,1 და მიკროგ/მლ და 0,01 & მიკროგ/მლ შემცველი ანალიზის ხსნარები მომზადდა 1.0 და მიკროგ/მლ ხსნარის განზავებით ანალიზის ბუფერთან 1:10 და 1: 100 შესაბამისად.

გამხმარი ქაშაყის სპერმის დნმ -ის განზავება მოხდა სამი სამუშაო ანალიზის ხსნარის გამოყენებით, თითოეული შეიცავს საღებავის განსხვავებულ კონცენტრაციას, როგორც გამხსნელი. მას შემდეგ, რაც განზავებები გაკეთდა, 200 მლ ნაშთები მიედინება მიკროპლატის ჭაბურღილში ექვსჯერ. ფლუორესცენცია განისაზღვრა BioTek Instruments FL600 ფლუორესცენტური ფირფიტების წამკითხველით 360 ნმ, 40 ნმ გამტარობით, აღგზნების ფილტრით და 460 ნმ, 40 ნმ გამტარუნარიანობის ფილტრის გამოყენებით. მონაცემები შეგროვდება ზემოდან ან ქვემოდან სტატიკური შერჩევის გამოყენებით 0.35 წამიანი დაგვიანებით, 100 კითხვა თითო ჭაბურღილზე სხვადასხვა მგრძნობელობის პარამეტრებში, როგორც ამას მოითხოვს ექსპერიმენტული პირობები. მიუხედავად იმისა, რომ ამ ექსპერიმენტებში ფირფიტები მაშინვე წაიკითხეს, თუ ისინი დალუქული და სინათლისგან დაცული დარჩა, რეაქცია რამდენიმე საათის განმავლობაში სტაბილური აღმოჩნდა.

შედეგები

ფლუორესცენციის ინტენსივობა განისაზღვრა დნმ -ის კონცენტრაციებისთვის 0 -დან 20 მკგ/მლ -მდე (სურათი 1). ამ დიაპაზონში ინტენსივობა გაიზარდა ხაზოვანი გზით.

Microsoft & reg Excel TM- ის გამოყენებით სულ მცირე ნიშნავს კვადრატული წრფივი რეგრესიის ანალიზის წარმოქმნას 0,999 განსაზღვრის კოეფიციენტით (r 2).

სტანდარტების ვარიაციის საშუალო კოეფიციენტი (%CV) იყო 2%-ზე ნაკლები, ყველაზე დიდი პროცენტული ცვალებადობა მოხდა დნმ -ის ქვედა კონცენტრაციებში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). მგრძნობელობის თვალსაზრისით, ანალიზი აღმოჩნდა მგრძნობიარე ნანოგრამის დონეზე. მგრძნობელობის შესაბამისი პარამეტრების მიხედვით, დნმ -ის კონცენტრაცია 40 ნგ/მლ -მდე სტატისტიკურად განსხვავებული იყო (p = 0.005) მხოლოდ სამუშაო ანალიზის ხსნარისგან, 0 ნგ/მლ დნმ, კონტროლი. DsDNA– ს რაოდენობრივი რაოდენობა Hoechst საღებავის 33258 ფლუორესცენტური თვისებების გამოყენებით BioTek FL600– თან ერთად მკვლევარებს საშუალებას აძლევს რაოდენობრივად განსაზღვრონ 8 ნგ/ჭაბურღილი (40 ნგ/მლ 0,2 მლ საერთო მოცულობაში). აღწერილი პირობების გამოყენებით, ანალიზი აღმოჩნდა წრფივი სიდიდის სამ ორდენზე მეტი.

უფრო დიდი მგრძნობელობის მისაღწევად, რიგი ღონისძიებების გატარებაა შესაძლებელი ფონის ფლუორესცენციის შესამცირებლად. სხვადასხვა მიკრო ფირფიტების გამოყენება, რომლებიც იყენებენ დაბალი ფლუორესცენტულ პლასტმასს, სავარაუდოდ შეამცირებს ფონს და შესაბამისად გაზრდის მგრძნობელობას. ანალოგიურად, ფონის ფლუორესცენციის შემცირება ასევე გაზრდის მგრძნობელობას. ხსნარში ბისბენზიმიდის თანდაყოლილი ფლუორესცენციის გამო, Hoechst 33258 საღებავის კონცენტრაციის შემცირება 1 და მიკროგ/მლ -ზე ქვემოთაა შემოთავაზებული, როგორც ფონის ფლუორესცენციის შემცირების საშუალება და ამით დნმ -ის დაბალი კონცენტრაციის გამოვლენის გაუმჯობესება (3). ჩვენი გამოვლენის ლიმიტების ოპტიმიზაციის მიზნით, ჩვენ შევეცადეთ გამოგვეხილა დნმ -ის კონცენტრაციებზე მიღებული ფლუორესცენტულ სიგნალზე საღებავის კონცენტრაციის ეფექტი.

The fluorescent intensity was determined for DNA concentrations ranging from 0 to 400 ng/ml using three different concentrations of bisbenzimide dye. Figure 2 demonstrates that decreasing dye concentrations result in lower fluorescent signals for a given DNA concentration even after correction for differing baseline fluorescent signals. Dye concentrations of 1.0 µg/ml and 0.1 µg/ml both produce a linear response with respect to DNA concentrations from 0 to 400 ng/ml, with coefficient of determination values indicating a high degree of confidence (r 2 =0.97 and r 2 =0.98 respectively).

Further dilution of the dye concentration to 0.01 µg/ml results in a hyperbolic shaped curve indicating that for DNA levels above 200 ng/ml the bisbenzimide dye is no longer in excess. From these data we decided that reducing the bisbenzimide dye concentration to 0.1 µg/ml would result in lower background fluorescence, yet provide adequate amounts of dye to provide linearity.

As demonstrated in figure 3, a ten fold reduction in dye concentration along with the use of microplates with low background fluorescence result in lower detection limits. In this experiment, using the lower Hoechst 33258 concentration of 0.1 µg/ml reduced the detection limit to 3 ng/ml (p=0.03) or approximately 600 pg/well. The average coefficient of variation (%CV) of the standards was still less than 2% (data not shown).

Because a low fluorescent signal can be offset by an increase in the sensitivity setting on the FL600, the effect of different sensitivity settings on the fluorescent signal was tested using 0.1 µg/ml Hoechst 33258 dye with DNA concentrations ranging from 0 ng/ml to 400 ng/ml. As shown in figure 4, increasing the sensitivity will increase the fluorescent signal obtained from a given DNA and bisbenzimide dye combination. It is important to note that by correcting each sensitivity setting to zero for the 0 ng/ml DNA sample, any increase in signal due to an increase in the background fluorescence has been eliminated. After correction, the signal at each specific DNA concentration is amplified with an increase in the sensitivity, resulting in divergent increasing values. A simple increase in the baseline fluorescence would result in parallel lines that would be superimposed upon one another after correction.

დისკუსია

Optimization of assay conditions must be determined empirically, as several factors must be weighed against one another. For most investigators using the conditions described by Labarca and Paigen (3) will be adequate. In fact, using a Hoechst 33258 dye concentration of 1.0 µg/ml would be expected give a linear response to a wider range of DNA concentrations than lower dye concentrations. Alternatively for low levels of DNA the use of 0.1 µg/ml dye concentrations may be more appropriate, as background fluorescence is reduced. The caveat of this condition being a decrease in fluorescent signal response resulting in a flatter dose response. The reduction in fluorescent signal in turn can be compensated for by increasing the sensitivity setting on the FL600 fluorescent plate reader, but in doing so, earlier saturation of the photomultiplier tube results in the loss of ability to quantitate higher levels of DNA. The ability to adjust both the assay and the FL600 allows the user to adjust the assay to meet his or her individual needs.

The ability to perform this assay in microplates offers several advantages over the conventional tube-based fluorescence assays. Like most assays that are performed in microplates, the ability to use multi-channel pipettes greatly reduces the manual labor required to perform the assay. The microplate format also lends itself to 'off the shelf' automation for laboratories with high volume requirements. The smaller reaction volumes in microplates will lead to lower per assay costs by reducing the amount of expensive reagents necessary to perform the assay.

ცნობები

(1) Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.

(2) Daxhelet, G.A., M.M. Coene, P.P. Hoet, and C.G. Cocito (1989) Analytical Biochemistry 179:401-403.

(3) Labarca, C. and K. Paigen (1980). Analytical Biochemistry 102:344-352.


Fluorescence Microplate Assays

Combining the sensitivity of a fluorescence-based assay with a microplate format enables a rapid, quantitative readout suitable for high-throughput analysis. In a microplate well, the fluorescent signal can be generated within whole cells, in cell lysates, or in purified enzyme preparations and may then be analyzed by measuring fluorescence intensity from the well without the need for cellular imaging.

Many of these assays include substrates, buffers, and calibration standards as well as kinetic or endpoint protocols.


Phosphorescence

To understand the difference between fluorescence and phosphorescence, we need to take a little detour into electron spin. Spin is a fundamental, unvarying property of the electron and a form of angular momentum that defines behavior in an electromagnetic field. Electron spin can only have the value of ½ and the spin orientation is either up or down. An electron’s spin is therefore designated as +½ or -½, or alternatively as ↑ or↓. Two electrons in a single orbital will always have antiparallel spin at singlet ground state (S0). Upon promotion of one electron into excited state, the electron maintains its spin orientation and a singlet excited state (S1) is formed, where the both spin orientations remain paired as antiparallel. All relaxation events in fluorescence are spin neutral and the spin orientation of the electron is maintained at all times.

However, this is different for phosphorescence. Fast (10 -11 to 10 -6 sec) Intersystem crossing from singlet exited state (S1) to an energetically favorable triplet excited state (T1) leads to inversion of the electron spin. Triplet excited states are characterized by parallel spin of both electrons and are metastable. Relaxation occurs via phosphorescence, which results in another flip of the electron spin and the emittance of a photon. The return to relaxed singlet ground state (S0) might occur after considerable delay (10 -3 to >100 sec). Additionally, more energy is dissipated by non-radiative processes during phosphorescent relaxation than in fluorescence, therefore the energy difference between the absorbed and emitted photon is bigger and the wavelength shift more pronounced. Thus, phosphorescence is characterized by a bigger Stokes shift than fluorescence.