ინფორმაცია

გენომური დნმ -ის იზოლაცია ხორბლისგან


შემიძლია გამოვიყენო მშრალი თესლი, ხორბალი, მაგალითად, ახალგაზრდა ფოთლების ნაცვლად, გენური დნმ -ის გამოსაყოფად და PCR გაძლიერებისთვის?

ჩემი ექსპერიმენტის მიზანია ახალი გენის გადამოწმება, რომელიც არ არსებობს ან იმყოფება კონკრეტულ ქრომოსომაში.


დიახ, მე ვცადე ეს და მივიღე კარგი შედეგი. თქვენ ყველაზე მეტად შეარჩიეთ საუკეთესო პროტოკოლი და ეს უნდა გააკეთოთ ხელით. მე გირჩევთ გამოიყენოთ CTAB-PVP (რომელიც იყენებს 3 ბუფერულ EBA EBB SDS %10) მოპოვების მეთოდს "ინტეგრირებული დნმ ტექნოლოგიებიდან" და თუ ამას ვერ პოულობთ მე გეტყვით.


MACGYVER პროექტი: გენომური დნმ -ის ექსტრაქცია და ლარის ელექტროფორეზის ექსპერიმენტები, რომელიც გამოიყენება ყოველ დღე მასალებით


Აბსტრაქტული:
დნმ -ის მოპოვება და გამოყოფა აგაროზის გელის ელექტროფორეზით არის მარტივი და ამაღელვებელი პროცესი, რომლის შესრულებაც ნებისმიერს შეუძლია. თუმცა, სპეციალიზებული აღჭურვილობისა და ქიმიკატების მაღალი ღირებულება ხშირად აფერხებს ასეთი ექსპერიმენტის ჩატარებას უმაღლესი სკოლის საზოგადოების წევრების მიერ. აქ ჩვენ აღწერს დნმ -ის მოპოვებისა და ელექტროფორეზირების ეფექტური გზას დადგენილი MacGyver შეზღუდვით - ეს არის მხოლოდ მასალის გამოყენება, რომელიც ხელმისაწვდომია სასურსათო მაღაზიიდან ან სავაჭრო ცენტრიდან.

ამ პროექტის განსახორციელებლად, ჩვენ გადავწყვიტეთ, რომ პროცედურა გავყოთ სამ კონკრეტულ ნაწილად, თითოეულ მათგანზე ინდივიდუალურად. ამით თქვენ აღმოაჩენთ, რომ შემდეგი გამოწვევები არსებობს. ესენია: (i) დნმ -ის მოპოვება, (ii) დნმ -ის გელ ელექტროფორეზი და (iii) დნმ -ის ვიზუალიზაცია.

დნმ -ის მოპოვება კვლევის გარემოში:
ჩვეულებრივი კვლევის პირობებში, დნმ -ის მოპოვების პირველი ნაბიჯი მოიცავს უჯრედის მემბრანის გახსნას ფიზიკური ან ქიმიური საშუალებების გამოყენებით. მაგალითები მოიცავს სონიზაციის (ხმოვანი ტალღების) გამოყენებას, ჰომოგენიზაციის მოწყობილობას (ბლენდერი, ფრანგული პრესი, ნაღმტყორცნები და მავნებლები) ან სარეცხი საშუალებების შერჩევითი გამოყენება. ჩვენთვის სარეცხი საშუალებების (ან საპნების) ან ფიზიკური საფეხურების (ნაღმტყორცნები და მავნებლები) კვლევა იყო ყველაზე აშკარა არჩევანი.

როდესაც უჯრედი/ქსოვილი ლიზდება, ჩვეულებრივ შემდგომი ნაბიჯები გულისხმობს თქვენი დნმ -ისთვის ნიმუშის გაწმენდის ან გამდიდრების მცდელობას (ანუ მოიშორეთ სხვა ნივთიერებები). ეს შეიძლება გაკეთდეს მრავალი გზით, რომელთაგან ბევრი ტექნიკურად შეუძლებელია ჩვენი MacGyver რუბრიკის მიხედვით. თუმცა, უჯრედის ლიზატის ადვილად გამდიდრება შესაძლებელია დნმ -ისთვის ალკოჰოლის გამოყენებით დნმ -ის შერჩევით დასაჩქარებლად, მისი ფორმირების მიზნით, რათა შეჯვარდეს "სნოტში" მსგავს არსებაში. შესაბამისად, ჩვენ გადავწყვიტეთ ფოკუსირება გენომური დნმ -ის მოპოვებაზე, ვინაიდან ამ ტიპის ნიმუში საუკეთესოდ მუშაობს ალკოჰოლის ნალექის პროტოკოლის მიხედვით და ასევე არის დნმ -ის ყველაზე უხვი სახეობა ვიზუალიზაციის სიმარტივისათვის როგორც მოპოვების, ასევე გელის საფეხურებზე.

გენომიკური მომზადება ასევე საინტერესოა საგანმანათლებლო თვალსაზრისით. მასწავლებელს შეეძლო დასვა "რატომ სურთ ადამიანებს გენომიკური დნმ?" - შეკითხვა, რომელმაც შეიძლება გამოიწვიოს მრავალი დისკუსია ახალი გენების, ორგანიზმების (დოლი ცხვარი) კლონირებასთან დაკავშირებით, რომელსაც აქვს დნმ -ის წყარო თითის ანაბეჭდის მიზნით (CSI, სასამართლო ექსპერტიზა ), ან თუნდაც ნიმუშის მომზადება ორგანიზმის მთელი გენომის თანმიმდევრობისათვის (Human Genome Project). გენომურ დნმ -ზე ფოკუსირება ასევე საშუალებას აძლევს სტუდენტს შეისწავლოს ნიმუშები სხვადასხვა წყაროდან, სადაც არსებობს გონივრული შესაძლებლობა, რომ გენომის ზომებში განსხვავებები გაირკვეს. როგორც ბონუსი, დნმ -ის დალევა "სნოტის" მსგავს ფორმაში დამატებით "ვაუ" ფაქტორს მატებს საქმიანობას.

მაკგივერის დნმ -ის მოპოვება:
ექსპერიმენტის ამ ნაწილის რეაგენტები და მასალები საკმაოდ მარტივია. აქ თქვენ უნდა იპოვოთ ქსოვილის წყარო, გარკვეული სახის ფიზიკური დაშლა, სუფთა წყალი/ბუფერული ხსნარი, საპონი და ალკოჰოლი. გარდა ამისა, ამისათვის საჭიროა გარკვეული სახის კონტეინერი, სასურველია გამჭვირვალე.

ქსოვილის წყარო:
მიუხედავად იმისა, რომ დნმ -ის ქიმიური მახასიათებლები ორგანიზმიდან ორგანიზმამდე პრაქტიკულად იდენტურია, უჯრედი, რომელშიც ის არის მოთავსებული, შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს. შესაბამისად, ქსოვილის არჩევანი არის ყველაზე დიდი ცვლადი, მაგრამ შეიძლება ითქვას, რომ საუკეთესო ელემენტია სტუდენტისთვის, რომ ითამაშოს. ჩვენ შევეცადეთ დნმ -ის ამოღება ხახვიდან, დაჭრილი ბარდადან, სიმინდიდან, საფუარიდან, ლობიოს ყლორტებიდან, ხორბლის ჩანასახიდან, კივიდან, ბანანიდან და ადამიანის ლოყის უჯრედებიდანაც, ეს ყველაფერი წარმატების სხვადასხვა ხარისხით. ჩვენ ვხვდებით, რომ საერთო ჯამში, კარგი დნმ -ის მიღწევა შესაძლებელია ნებისმიერი ახალი პროდუქტით ან მარცვლეულის მასალით, რამდენადაც ექსპერიმენტატორი მზად იქნება ვითამაშოთ ოპტიმალური პირობების საპოვნელად. საერთო ჯამში, ჩვენ გირჩევთ ხახვის ან ბანანის ქსოვილს, როგორც დნმ -ის დაბალი მოპოვების საუკეთესო წყაროებს. ჩვენ ასევე გირჩევთ ხორბლის ჩანასახს, რადგან არსებობს "სწრაფი" პროცედურა, რომელიც ძალიან კარგად მუშაობს. დაბოლოს, სტუდენტის ლოყის უჯრედებიდან იზოლირებული დნმ არის საინტერესო ალტერნატივა, ვინაიდან ის აქტივობის პირად ელემენტს შემოაქვს. თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ ლოყის უჯრედებისგან იზოლაცია ნაკლებად საიმედოა.

ფიზიკური ნაბიჯი:
ქსოვილის მიხედვით, რომელსაც იყენებთ, ფიზიკური ნაბიჯი შეიძლება იყოს გარანტირებული. ეს შეიძლება იყოს ისეთივე, როგორიც არის ქსოვილის მოჭრა და შემდეგ ნაღმტყორცნების და მავნებლების გამოყენება, ან ისეთი უმნიშვნელო, როგორიც არის ხის ჩოხთან ერთად დარტყმა. ზოგადად, მცენარეული მასალისა და ხორცის ჭრა ისარგებლებს ასეთი ნაბიჯით, რადგან მცენარეებს აქვთ მტკიცე უჯრედის კედელი, ხოლო ხორცი ჩვეულებრივ შეიცავს კუნთების მკაცრ შტრიხებს.

ბუფერული ხსნარი:
ეს არის სითხე, რომელშიც ნიმუში უნდა ჩაეფლო და, როგორც ასეთი, აქვს როლი უბრალოდ შეინარჩუნოს შენი დნმ უსაფრთხო. არსებობს მრავალი შესაძლო ბუფერი MacGyver, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას მოპოვების პროცედურისთვის, რომელიც ძირითადად მუშაობს (იხ. ცხრილი 1). ამასთან, უნდა გავითვალისწინოთ, რომ გამოხდილი ან ჩამოსხმული წყალი უნდა იქნას გამოყენებული. როგორც ჩანს, ონკანის წყალი უმნიშვნელო გავლენას ახდენს მოპოვების პროცედურაზე და რეალურად ძალიან საზიანოა შემდგომში აღწერილი გელის შემდგომი ნაბიჯებისთვის.

პასუხი: "მარილიანი ბუფერი"
0.9% მარილიანი (კონტაქტური ლინზების ხსნარი)

B: "რეგულარული ბუფერი"
1.5 გ სუფრის მარილი (NaCl)
5.0 გრ საცხობი სოდა (ნატრიუმის ბიკარბონატი)
წყლით 120 მლ -მდე საბოლოო მოცულობამდე

C: "მჟავა ბუფერი"
1.5 გ სუფრის მარილი (NaCl)
5.0 გრ საცხობი სოდა (ნატრიუმის ბიკარბონატი)
5 მლ ძმარი
წყლით 120 მლ -მდე საბოლოო მოცულობამდე

D: "პროტეინაზას ბუფერი"
1.5 გრ სუფრის მარილი
5.0 გრ საცხობი სოდა
2.5 მლ თვალის სრული ხსნარი ან 2 ცილის ტაბლეტი (სრული ბრენდი)
წყლით 120 მლ -მდე საბოლოო მოცულობამდე

E: "ხორცის ტენდერიზატორის ბუფერი"
100 მლ ცხელი წყალი
3 გრ ხორცის გამაგრილებელი

*გაითვალისწინეთ, რომ მარტო წყლის ეფექტურად გამოყენებაც შეიძლება.

საპონი/სარეცხი საშუალება:
ჭურჭლის სარეცხი საპონი ჩვეულებრივ გამოიყენებოდა. სპეციფიკის თვალსაზრისით, ჩვენ ვიპოვნეთ უკეთესი შედეგები, როდესაც საპონი უფერო იყო და აღმოვაჩინეთ, რომ უსუნო ვერსიები შეიძლება საუკეთესოდ მუშაობდეს მთლიანობაში. არსებითად, სასურსათო მაღაზიებში არსებული საპნების უმეტესობას აქვს დანამატები, რომლებიც ასრულებენ როლს შენარჩუნებაში, სურნელში, ფერში, ლაქების მოცილებაში და ა.შ. თქვენ არ გაქვთ წარმატება თქვენი მოპოვებით. ზოგადად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ დაახლოებით 5 მლ (ან ნაკლები) სარეცხი საშუალების გამოყენება 120 მლ ხსნარზე კარგად მუშაობს.

გაფილტვრა:
ქსოვილის არჩევიდან და ასევე ქსოვილის ოდენობიდან, რომლის გამოყენებაც გადაწყვიტეთ, შეიძლება შესაბამისი იყოს ნარჩენების მოსაშორებლად ფილტრაციის საფეხურის ჩართვა. ეს შესაძლებელს გახდის დნმ -ის სნოტის ეფექტის უკეთეს ვიზუალიზაციას დასასრულს. გაფილტვრა ადვილად შეიძლება განხორციელდეს ყავის ფილტრების ან ყველის ქსოვილის გამოყენებით. გაითვალისწინეთ, რომ ყველის ქსოვილის გამოყენებისას, თქვენ დაგჭირდებათ ყველის ქსოვილის 3-4 ფენა. ყავის ფილტრები ზოგადად უფრო ადვილია, რადგან ისინი უფრო იაფია, უფრო ხელმისაწვდომი და ადვილი გასასუფთავებელია.

ნალექები ალკოჰოლთან ერთად:
დნმ -ის ნალექი ხდება ალკოჰოლთან კონტაქტით. ეს ალკოჰოლი ხელმისაწვდომია აფთიაქებში, როგორც 99% იზოპროპანოლის ჯიშის სპირტი. გარდა ამისა, სკოლების უმეტესობას ექნება წვდომა ეთანოლის 95% -იან მარაგზე. ალკოჰოლი უნდა დაემატოს ფენების ფორმას ისე, რომ დაინახოს დნმ, რომელიც წარმოიქმნება თქვენს ნიმუშსა და ალკოჰოლს შორის. თქვენ უნდა დაამატოთ მინიმუმ ორჯერ თქვენი ორიგინალური ნიმუშის მოცულობა. თუ თქვენ ვერ ხედავთ "სნოტის" ფორმირებას, მაშინ ყველაფრის ერთმანეთში შერევამ უნდა მიიღოს სასურველი ეფექტი. გაითვალისწინეთ, რომ თუ თქვენ აპირებთ მიმართოთ შერევას, მაშინ ფილტრაციის ნაბიჯი შეიძლება განსაკუთრებით აუცილებელი იყოს ვიზუალიზაციის სიმარტივისთვის.

დნმ ილექება ალკოჰოლის დამუშავების დროს, რადგან ის ბუნებრივად ჰიდროფობიურია და, როგორც ასეთი, მიდრეკილია შეკრებდეს, თუ გამხსნელი არ არის ოპტიმალური (ანუ წყალი). შედეგად, ალკოჰოლის დამატება თქვენს მოსამზადებლად ნიშნავს იმას, რომ დნმ არ არის სრულად გამხსნელი მის ოპტიმალურ გარემოში (წყალი) და, შესაბამისად, დაგროვდება და ილექება ხსნარიდან. უნდა აღინიშნოს, რომ დაგროვების ხარისხი და სიადვილე დამოკიდებული იქნება დნმ -ის რაოდენობაზე და ასევე მისი კონცენტრაციაზე. ამიტომ, თუ თქვენ ხედავთ დნმ -ის მინიმალურ რაოდენობას, თქვენ უნდა შეგეძლოთ ამის გამოსწორება (i) მეტი ქსოვილისგან იზოლირების მცდელობით და (ii) მასალის ხელახლა გამოდევნა მცირე მოცულობის სითხეში.

ცხრილი 2: შემოთავაზებული MACGYVER გენომური დნმ -ის ექსტრაქციის პროტოკოლები:

ზოგადი პროტოკოლი
1. საჭიროების შემთხვევაში, გაყავით დნმ -ის არჩეული წყარო. გამოიყენეთ ოდენობა მარწყვის ზომის შესახებ.
2. ნაღმტყორცნისა და მავნებლის გამოყენებით გახეხეთ ნიმუში თანდათანობით დაამატეთ 10 მლ მომზადებული ბუფერული ხსნარი უკვე დამატებული სარეცხი საშუალებით. გახეხეთ მინიმუმ 5 წუთის განმავლობაში მთელი თქვენი წონით და სიძლიერით, რათა უზრუნველყოთ უჯრედის მემბრანის გახსნა და კრემის წვნიანის კონსისტენციის მიღწევა. თუ ნიმუში ძალიან სქელია დაფქვის შემდეგ, დაამატეთ მეტი მარილიანი ხსნარი ოპტიმალური სისქის მისაღწევად ისე, რომ ნიმუშის თხევად ნაწილს შეეძლოს გაიაროს ფილტრი, ხოლო უფრო დიდი ფიჭური მასალა რჩება ფილტრზე. შენიშვნა: თუ დნმ -ის ნიმუში გაყინულია, მისი გახეხვა გაცილებით ადვილია.
3. გაფილტრეთ თქვენი ნიმუშის წვენი პატარა ჭიქაში. გამოსავალი ჩაუშვით ჭიქაში, სანამ ყველა სითხე არ გაივლის ფილტრს. თუ ამას დიდი დრო დასჭირდება, უბრალოდ გამოწურეთ ყველა წვენი ნიმუშიდან ფილტრის საშუალებით.
4. დაამატეთ 2 ტომი (ეს ნიშნავს, რომ ნიმუშის მოცულობაზე დაახლოებით ორჯერ მეტია) ყინულის ცივი სპირტი ჭიქის მხარეს ჩალის ან პასტერული პიპეტით. გააკეთეთ ეს ნაბიჯი ნელა, რათა ალკოჰოლმა შექმნას ფენა წვენის ფენის თავზე. ჭიქის გაჩერებისას დნმ უნდა დაჩქარდეს. რაც უფრო დიდხანს ელოდებით, მით მეტი დნმ უნდა ნახოთ. თუ ნალექებს ვერ ხედავთ, ნაზად აურიეთ ყველაფერი ერთმანეთში.
5. დნმ -ის ნალექი უნდა წააგავდეს გამჭვირვალე თეთრი ნაოჭის ძაფს, წვენსა და ალკოჰოლს შორის. მნიშვნელოვანი დროის გასვლის შემდეგ, დნმ შეიძლება საბოლოოდ დაფრინდეს ალკოჰოლის ფენის თავზე.
6. თქვენ შეგიძლიათ დნმ ამოიღოთ ხის ყლორტის ჯოხით ან მინის ჯოხით. დნმ კარგად იჭერს ხეს.

სწრაფი პროტოკოლი
1. ჩაასხით კოვზი ან ნაკლები ხორბლის ჩანასახები თქვენს ჭიქაში.
2. დაამატეთ დაახლოებით 10 მლ გამოხდილი წყალი და ნაზად დააქუცმაცეთ ყურძნის ჯოხით/ჩოპტიკით 1 წუთის განმავლობაში.
3. შემდეგ დაუმატეთ ჭურჭლის სარეცხი ნაყენი და ნაზად დაჭერით ყურძნის ჯოხით 2 წუთის განმავლობაში.
4. ნელ -ნელა დაასხით ალკოჰოლი აურიეთ ჯოხის სიგრძეზე, დაასხით სპირტი წყლის თავზე.
5. დადეთ კონტეინერი მაგიდაზე და მოძებნეთ დნმ ალკოჰოლსა და წყალს შორის.

ლოყის უჯრედის პროტოკოლი
1. გაზომეთ 10 მლ "რეგულარული ბუფერი (ცხრილი 1 -დან), დაასხით ბუფერი პირში და ატრიალეთ ლოყებზე დაახლოებით 1 წუთის განმავლობაში.
2. დაასხით წყალი ისევ კონტეინერში, სასურველია რაიმე შედარებით ვიწრო, როგორიც არის სინჯარა.
3. ჩაასხით ცოტაოდენი თხევადი საპონი ნიმუშზე და კარგად აურიეთ ყურძნის ჯოხით. თუ შეგიძლიათ შეურიოთ ინვერსიით, გააკეთეთ ეს ნაზად დაახლოებით 20 -ჯერ.
4. ნელ -ნელა დაამატეთ 10 მლ ცივი სპირტი ნიმუშს და დარწმუნდით, რომ დაასხით იგი სინჯარის გვერდით ისე, რომ ჩამოყალიბდეს ორი ფენა. ამის გაკეთება ძალიან ნაზად, ჩალის და ა.შ. მნიშვნელოვანია, რომ ეს ორი ფენა არ იყოს დარღვეული.
5. დაელოდეთ დაახლოებით 10 წუთს და დნმ გამოჩნდება ალკოჰოლის ფენაზე.

დნმ -ის გელის ელექტროფორეზი კვლევის გარემოში:
ელექტროფორეზი არის მოლეკულების გამიჯვნა მუხტისა და ზომის მიხედვით. ჩვენს შემთხვევაში, ჩვენ გვსურს გამოვყოთ გენომის დნმ -ის სხვადასხვა ზომის მოლეკულები, რომლებიც მიიღება ხილიდან, ბოსტნეულიდან და საფუარიდან. საერთოდ, პოლისაქარიდის პოლიმერები, როგორიცაა აგაროზა ან აკრილამიდი, გამოიყენება ელექტროფორეზის გელების შესაქმნელად. ვინაიდან დნმ უარყოფითად არის დამუხტული, მას შეუძლია აიძულოს იმოძრაოს გელში სისტემაში ელექტრული ველის გამოყენებით. ჩვეულებრივ, ეს მიიღწევა სპეციალური გელის აპარატის გამოყენებით, რომელიც შექმნილია „გელის“ წარმოების ან ჩამოსხმის გასაადვილებლად, ასევე საშუალებას აძლევს პლატფორმას ჩაასხას გელი იონში შემცველ ბუფერში, ელექტრული ველის შესაქმნელად. ასეთი აპარატი იმუშავებს მინიმუმ $ 500, და კვების ბლოკები, რომლებიც ჩვეულებრივ გამოიყენება მიწოდებისთვის

80V ძაბვა შეიძლება მუშაობდეს მსგავსი ფასების დიაპაზონში. შესაბამისად, MacGyver– ის პროექტის ეს ასპექტი უდავოდ არის ორიენტირებული ხარჯების დაზოგვაზე და ძირითადად კონცენტრირებულია აგაროზის შემცვლელის პოვნაზე და გელის აპარატის წარმოების მიმართულებებზე.

დნმ -ის მაკგივერ გელის ელექტროფორეზი:
გელის მასალა:
აგაროზა არის ზღვის მცენარეების კომპონენტი და, როგორც ასეთი, არის დახვეწილი გაწმენდილი მოლეკულა, რომელიც მიიღება ჩვეულებრივი საკვების გამაძლიერებლისგან, რომელიც ცნობილია როგორც "აგარის აგარი". რომელიც სხვათა შორის ადვილად შეიძლება მოიძებნოს აღმოსავლური სტილის საკვების უმეტეს მაღაზიებში. "აგარ აგარის" შეძენა შესაძლებელია როგორც ფანტელის, ნუშის ან ფხვნილის სახით. შეეცადეთ დარწმუნდეთ, რომ ის არ შეიცავს დამატებით ინგრედიენტებს (მაგალითად, გლუკოზას), რადგან ამ ინგრედიენტებმა შეიძლება ხელი შეუშალოს გელის მატრიცის წარმოქმნას. გელის დასამზადებლად რეკომენდირებულია გამოიყენოთ "აგარი აგარი" ფხვნილის სახით, ვიდრე ფანტელის ან ლაქის სახით. სხვა უფრო დიდი ფორმები, როგორც წესი, მოითხოვს ჭრას და დამატებით გაფილტვრას, რაც პრობლემური და ძალიან არეულია.

გაშვებული ბუფერი:
თქვენ უნდა მოამზადოთ გაშვებული ბუფერი, რომელიც საჭიროა გელის დასამზადებლად და ასევე საჭიროა როგორც სითხე, რომელიც საბოლოოდ ჩაძირავს თქვენს გამაგრებულ გელს, რათა დაუშვას ელექტრული ველი. Macgyver გაშვებული ბუფერული რეცეპტი ასეთია:

– 0.05 გ NaCl (ეს არის პრინციპული იონი)
– 2 გრ საცხობი სოდა (ნატრიუმის ბიკარბონატი)
– მიიყვანეთ 1 ლ -მდე გამოხდილი ბოთლის წყლით

pH გამოიყენებოდა შინაური ცხოველების მაღაზიის აკვარიუმის pH ნაკრები დაახლოებით pH7.5. (ჩვენ გამოვიყენეთ Seqchem– ის მიერ დამზადებული ტუტე ბუფერი).

გელის აპარატი:
მიუხედავად იმისა, რომ კვლევის გელის ყუთი ძვირია, ის სინამდვილეში შედარებით მარტივი აღჭურვილობაა. არსებითად, ეს არის დიდი კონტეინერი (მოდი ვუწოდოთ მას ბუფერული კამერა), რომელსაც შეუძლია შეინარჩუნოს სითხე, რომლის საპირისპირო ბოლოები დაკავშირებულია ენერგიის წყაროსთან, რომელიც ქმნის პოზიტიურ/უარყოფით ელექტროდის სცენარს. ბუფერულ პალატას უნდა შეეძლოს მოხერხებულად დაიჭიროს პატარა კონტეინერი (მოდი ამას ვუწოდოთ გელის ჩამოსხმის პალატა), რომელიც გამოიყენება გელის დასამზადებლად და შესანახად. უფრო მეტიც, გელის ჩამოსხმის უფრო პატარა პალატა უნდა მოთავსდეს ისე, რომ შუაში იყოს ბუფერული პალატის ორ ელექტროდს შორის.

ამ ელექტროფორეზის ყუთის აწყობა საკმაოდ მარტივი და სასიამოვნო უნდა იყოს მათთვის, ვისაც უყვარს „ნივთების კეთება“. ჩვენ აქ შევიტანეთ მულტფილმის სახელმძღვანელო (სურათი 1) ამ ორი პალატის საერთო პლასტმასისგან დამზადებისათვის (ტუპერის ჭურჭელი, საპნის ჭურჭელი და სხვა). ელექტროდების კავშირისთვის ჩვენ შემოვიფარგლეთ უჟანგავი ფოლადის ხრახნებით (5 სმ) და უჟანგავი ფოლადის მავთულხლართებით (20 ლიანდაგი), რომლებიც კარგად მუშაობდნენ. ამასთან, ელექტროდების უფრო დახვეწილი სისტემის გაკეთება ადვილი იქნებოდა ტექნიკის სათანადო მაღაზიის მონახულებით.

როგორც tupperware– ის გამოყენების ალტერნატივა, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ Lego ძალიან სასარგებლოა ბუფერული პალატის მორგებაში თქვენი გელის ჩამოსხმის პალატაში. გაითვალისწინეთ, რომ ლეგოს პალატა უნდა იყოს გაფორმებული წყალგაუმტარი მასალით, მაგრამ ცოტა ხნის წინ გლადმა შეიმუშავა ახალი მასალა "Glad Press'N Seal", რომელიც მშვენივრად მუშაობს და ადვილია მისი მართვა.

დაბოლოს, „სავარცხელი: უნდა გაკეთდეს. ეს არის უკუჩვენება, რომლის საშუალებითაც შესაძლებელია მცირე ჭაბურღილების ჩამოყალიბება თქვენს გელში. აქ, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ლეგო განსაკუთრებით სასარგებლოა, მაგრამ შეკრული, ჩვენ ასევე გავაკეთეთ სავარცხლები პლასტმასის ნაჭრების ამოჭრით, ან ნამდვილი თმის სავარცხლის კბილებით.

ფიგურა 1: MACGYVER GEL ყუთის სამშენებლო ჩანაწერები.

გელის მომზადება:
ფხვნილის "აგარ აგარის" გამოყენებით თქვენ გინდათ გააკეთოთ 1.2% -დან 1.5% -მდე გელი (w/v ან 1.2g to 1.5g 100ml გაშვებულ ბუფერზე). ცალკე კონტეინერში, (მაგალითად, კოლბაში) აწონით საჭირო რაოდენობის "აგარ აგარი" და დაამატეთ საჭირო რაოდენობის გაშვებული ბუფერი (კონკრეტული რაოდენობა იქნება ნაკარნახევი თქვენი გელი ჩამოსხმის კომპლექტის ზომით). კოლბა უნდა იყოს საკმარისად დიდი ისე, რომ "აგარ აგარის" ხსნარი წარმოქმნას 2 სმ ფენას ძირში. ეს საჭიროა იმისთვის, რომ უზრუნველყოს დიდი ფართობი ცხელ ფირფიტასთან კონტაქტში ეფექტური დნობისთვის. მიზანშეწონილია გამოიყენოთ ცხელი ფირფიტა და განაგრძოთ მორევა აგარის ხსნარის თანაბრად გასათბობად. ალტერნატივაა მიკროტალღოვანი ღუმელის გამოყენება, მაგრამ ამ მეთოდით უნდა გამოიყენოთ დაბალი სითბოს დონე მცირე ინტერვალებით, ნარევის ხშირად მორევისას. თუ ეს პროცედურა ფრთხილად არ ჩატარებულა, ხსნარი სავარაუდოდ გადმოდუღდება და დიდ არეულობას შექმნის. გაითვალისწინეთ, რომ თუ "აგარ აგარის" ხსნარი სრულად არ დაიშალა, ეს დიდ გავლენას მოახდენს დნმ -ის მობილურობაზე გელის გავლით. გარდა ამისა, შეღებვის პროცესში შეღებილი იქნება აგარის გადაუჭრელი ნაწილაკები, რაც ართულებს დნმ -ის ზოლების ნახვას.

შენიშვნა: ზოგიერთ სკოლას აქვს წვდომა "აგარზე", რომელიც გამოიყენება ბაქტერიული ფირფიტების დასამზადებლად. ეს მასალა ძალიან კარგად მუშაობს გელის ჩამოსხმისას (ბევრად უკეთესია ვიდრე "აგარ აგარი") ჩვენ გირჩევთ გააკეთოთ 1% w/v ლარი გენომიკური ვიზუალიზაციის მიზნით.

დარწმუნდით, რომ თქვენ დალუქული გაქვთ თქვენი ჩამოსხმის გელის პალატის ღია ბოლოები ნიღაბი ლენტით ან მსგავსი მასალით. ჩაასხით გამდნარი ნარევი თქვენს ჩამოსხმის გელის პალატაში. დაიმახსოვრეთ ასევე ჩადეთ "სავარცხელი" ისე, რომ ჭაბურღილის ფორმირება მოხდეს. ოთახის ტემპერატურაზე დაახლოებით 20-30 წუთი დასჭირდება გელის გამყარებას. ამ ხნის განმავლობაში არ შეაწუხოთ ლარი. ლარი საკმაოდ დელიკატურია, ასე რომ იყავით ძალიან ფრთხილად, როდესაც თქვენ ამოიღებთ სავარცხელს თქვენი ნიმუშის ჩატვირთვამდე

ლარი უნდა დაასხით დაახლოებით 0.5 სმ -დან 1.0 სმ სისქემდე. უფრო სქელი გელი იძლევა ღრმა ჭაბურღილების გაკეთების შესაძლებლობას, რითაც საშუალებას იძლევა უფრო დიდი ნიმუშის დატვირთვა. თხელი გელები უფრო სწრაფად უნდა გაუშვათ. გაითვალისწინეთ, რომ თუ გელი ძალიან თხელია, ის შეიძლება იძირებოდეს ჩაძირვისას. შეეცადეთ გამოიყენოთ გელი რაც შეიძლება მალე. მიუხედავად იმისა, რომ თქვენ შეგიძლიათ გადაიტანოთ იგი პლასტმასის შეფუთვაში და შეინახოთ მაცივარში მთელი ღამის განმავლობაში, ისინი უკეთესად იმუშავებენ, როდესაც ახლად გამოიყენება.

დნმ -ის ნიმუშის მომზადება:
თქვენი გენომური დნმ -ის ამოღება შესაძლებელია ექსტრაქციის პროცედურის ბოლოს, ხის ჩხირის გამოყენებით. ამის შემდეგ დნმ უნდა ჩაეფლო 70% ალკოჰოლის ხსნარში, რაც ხელს უწყობს ჭარბი მარილების მოცილებას. ეს ძალზედ მნიშვნელოვანია ეფექტური დაითხოვოს, ასევე ეფექტური გელის გასაშვებად. ამის შემდეგ დნმ შეიძლება ჰაერში გაშრეს დაახლოებით 10 წუთის განმავლობაში, რათა აორთქლდეს ნარჩენი ალკოჰოლი, შემდეგ კი გადანაწილდეს მცირე მოცულობის ბუფერში (რაც უფრო მცირეა მით უკეთესი, ანუ & lt0.5 მლ). უნდა აღინიშნოს, რომ გენომურ დნმ -ს ხშირად შეიძლება დღეები დასჭირდეს, რომ სწორად დაიშალოს. ჩვენ გირჩევთ დაუშვათ დნმ -ის დაშლა ღამით ოთახის ტემპერატურაზე (თუ თქვენ გაქვთ წვდომა ტემპერატურაზე 50C- მდე, მაშინ ეს საუკეთესოა). იყავით ნაზი თქვენი ნიმუშის მიმართ, რადგან დიდი გენომური დნმ ძალიან მიდრეკილია გაპარსვისკენ. მას შემდეგ, რაც ღამით დაითხოვოს ნაბიჯი, განიხილეთ ეს თქვენი დნმ -ის ნიმუში, მიუხედავად იმისა დაიშალა თუ არა იგი დასრულებამდე.

შემდეგ თქვენს ნიმუშს დამუშავების ბუფერული დამუშავება დასჭირდება. ეს არსებითად არის ის, რამაც გამოიწვია თქვენი ნიმუშის ბლანტი ისე, რომ ის მართლაც „ჩაძირული“ იყოს თქვენს ჭაბურღილებში დატვირთვის დროს. ხშირად, დატვირთვის ბუფერს ასევე აქვს საღებავი, რომელიც იმოძრავებს იმავე მიმართულებით, როგორც დნმ, და ასევე აადვილებს გელის დატვირთვის დანახვას.

ჩვენი რეცეპტი ასეთია:
– 0.5 მლ გლიცერინი/გლიცერინი (ხელმისაწვდომია სააფთიაქო განყოფილებაში)
– 0.1 მლ გამოხდილი წყალი
– რამდენიმე წვეთი Club House Red Food Coloring (გაითვალისწინეთ, რომ საღებავის არჩევანმა შეიძლება დიდად იმოქმედოს შედეგზე - ჩვენ არ გვქონია დიდი წარმატება რაიმე კარგის პოვნაში, ამიტომ უკანასკნელი საშუალება იქნება საღებავის გარეშე გამოყენება).

ეს დატვირთვის ბუფერი შეიძლება გამოყენებულ იქნას 5X– დან 10X– მდე, რაც ნიშნავს, რომ 0.5 მლ ნიმუშისთვის დაგჭირდებათ 0,05 – დან 0,1 მლ ბუფერის დამატება. ფრთხილად აურიეთ. თქვენი ნიმუში მზად არის გელისთვის.

ლარი გაშვებული.
მოათავსეთ თქვენი გამაგრებული გელი (გელის ჩამოსხმის პალატაში) უფრო დიდ ბუფერულ პალატაში. დაამატეთ გაშვებული ბუფერი სანამ ლარი არ ჩაეფლო ისე, რომ გელის ზემოთ იყოს მინიმუმ 3 მმ სითხე. გაითვალისწინეთ, რომ რაც უფრო მეტ სითხეს დაამატებთ, ნელა გადის გელი.
თქვენს ჭაბურღილებში დატვირთეთ რაც შეიძლება მეტი ნიმუში (ჩატვირთვის ბუფერით). ეს ალბათ საუკეთესოდ კეთდება პლასტმასის ჩხირის საშუალებით, რომელიც მიმაგრებულია რეზინის ბოლქვებზე. არსებითად, თქვენ გსურთ შეაგროვოთ ისეთი რამ, რამაც შეიძლება სითხე მიაწოდოს პატარა მილში. მას შემდეგ, რაც ყველა ნიმუში დატვირთულია, თქვენ მოგინდებათ ელექტროდების დაკავშირება 9 ვ ბატარეების სერიასთან. თქვენი დნმ უარყოფითად არის დამუხტული, ასე რომ თქვენ გსურთ პოზიტიური ელექტროდი მოათავსოთ ჭაბურღილების ბოლოს "შორს". ძირითადად, ერთი ბატარეა საკმარისი იქნება, მაგრამ ძალიან ნელი იქნება (ღამის გათამაშების სცენარი). 5 -დან 7 -მდე ან მათ სერიულ წრედ უნდა იყოს მიწოდებული კარგი ძაბვა. გაითვალისწინეთ, რომ როდესაც ლარი გადის, ნუ ჩადებთ თითს სითხეში. გამოყენებული ბატარეების რაოდენობიდან გამომდინარე, 100mAmps დენი მიეწოდება (საკმარისია მცირე დარტყმის მისაღებად).

როდესაც წრე მუშაობს, კარგი ვიზუალური შემოწმებაა იმის დანახვა, რომ ბუშტები წარმოიქმნება მავთულის ელექტროდებიდან და ჩვეულებრივ ყველაზე მეტად ჩანს პოზიტიურ ბოლოს.

გელის გასაშვებად ოპტიმალური დრო, გულწრფელად რომ ვთქვათ, არის ძნელი პროგნოზირება, რადგან ეს დამოკიდებულია თქვენი გელის ზომაზე, თქვენი გელის სისქეზე, სისტემაში გაშვებული ბუფერის რაოდენობაზე, გამოყენებული ძაბვის რაოდენობაზე. და გაყვანილობის გაყვანილობაც კი გამოიყენება. შესაბამისად, ეს არის ერთადერთი რამ, სადაც აუცილებლად მოგიწევს თამაში. თუმცა, 5-დან 7 ბატარეის დაყენებით, თქვენ დაგჭირდებათ მინიმუმ მინიმუმ 1 საათი და შესაძლოა მეტიც. გარდა ამისა, თუ გენომის პრეფერენციების დიფერენცირება წესრიგშია (ანუ გენომის განსხვავებული ზომა), შეიძლება დაგჭირდეთ შემდგომი ექსპერიმენტები გაშვების დროს, რომ ნახოთ ეს პოტენციური განსხვავება.

დნმ -ის ვიზუალიზაცია კვლევის გარემოში:
ელექტროფორეზის დასრულების შემდეგ, საჭიროა ზოლების ადგილმდებარეობის ვიზუალიზაცია. ზოლების გამოვლენის საერთო გზაა გელის შეღებვა ეთიდიუმ ბრომიდით, რომელიც დნმ -ის სანახავად ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ ფლუორესცენტდება. სამწუხაროდ, ეთიდიუმის ბრომიდი და ულტრაიისფერი შუქი საშიშია (ეთიდიუმი არის კანცეროგენული და ულტრაიისფერი სხივები ადამიანის დამწვრობას შეუძლია უსაფრთხოების შესაბამისი ზომების გარეშე) და ამიტომ არ არის იდეალური საშუალო სკოლის მოსწავლეებში გამოსაყენებლად.

მაკგივერის გზა დნმ -ის ვიზუალიზაციისთვის:
დნმ -ის ზოლების ვიზუალიზაციის მიზნით, გელი შეღებილი იქნა მეთილენის ლურჯ ხსნარში. მეთილენის ლურჯი შედგება მარილის მეთილენის ლურჯი ქლორიდისგან. წყალში მარილი იშლება დადებითად დამუხტულ მეთილენის ლურჯ იონად, რომელიც შეფერილია ლურჯად და უარყოფითად დამუხტული ქლორიდის იონში, რომელიც უფეროა. ამ ცისფერ ქრომოფორს შეუძლია შემდეგში დაუკავშიროს დადებითად დამუხტულ დნმ -ს გელში. მეთილენის ლურჯი ლაბორატორიაში გამოსაყენებლად მოსახერხებელი ლაქაა, რადგან ქიმიურად უსაფრთხოა, მრავალჯერადი გამოყენება და 20ng- ზე მეტი დნმ/ზოლის არსებობას.

რაც მთავარია, მეთილენის ლურჯი მოხერხებულად გვხვდება ცხოველების უმეტეს მაღაზიებში. ის ჩვეულებრივ იყიდება როგორც აკვარიუმის სადეზინფექციო საშუალება 5% კონცენტრაციით. გელის შეღებვის საუკეთესო შედეგები მიღებულია მზა გელი 0,02% მეთილენის ლურჯში (გამოხდილ წყალში) ხსნარში ღამით ოთახის ტემპერატურაზე. ამ პროტოკოლის გამოყენებით, გამოხდილი წყლის ინკუბაციებით ჭარბი ფერის მოცილება არ იყო საჭირო. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ უფრო მაღალი კონცენტრაციის ხსნარებმა გამოიწვია გელის ძალიან მუქი შეღებვა, რაც ართულებს ფონის დინამიკას დნმ -ის ზოლებისგან. ეს დაფიქსირდა გამოხდილი წყლით მომარაგების შემდეგაც კი. ასევე, თუ "აგარ აგარის" ფხვნილი მთლიანად არ იყო გახსნილი გელში, გაუხსნელი ფანტელები შეღებილი იყო მუქი ლურჯში, რაც აფერხებდა მკაფიო, ხილული ზოლების წარმოქმნას.

ფიგურა 2: CORN GENOMIC DNA მოსამზადებელი მაკგივერის სტილი.

დასკვნები:
საერთო ჯამში, ჩვენ აღწერილი გვაქვს მეთოდების ეფექტური მონახაზი ზოგიერთი ძირითადი მოლეკულური ბიოლოგიის ტექნიკის შესასრულებლად MacGyver შეზღუდვით (სურათი 2). ამასთან, ჩვენ უნდა აღვნიშნოთ, რომ ამის გაკეთება თქვენს საკლასო ოთახში აუცილებლად მოითხოვს თქვენს საკუთარ მუშაობას. ეს გამოწვეულია მრავალი მოსაზრებით, როგორიცაა "მაქვს საკმარისი დნმ?" "რა არის ჩემი გელის კომპლექტი" "რა სახის სპეციალიზებული რეაგენტები მაქვს ჩემს განკარგულებაში, რომ საქმეები კიდევ უფრო ეფექტური იყოს?" და ა.შ. თუმცა, ვიმედოვნებთ, რომ აქ წარმოდგენილი ინფორმაცია გახდის თქვენს პრობლემებს რაც შეიძლება გლუვი. Წარმატებები!


რეტროტრანსპოზონებისა და განმეორებითი დნმ -ის ოჯახების ეფექტური იზოლაცია ხორბლის გენომიდან.

დნმ -ის განმეორებითი ელემენტების ახალი კლასები ეფექტურად იქნა გამოვლენილი ხორბლის გენომიდან ელემენტების მცირე ფრაგმენტების იზოლირებით. ხორბალი გენომის ბიბლიოთეკა აშენდა Triticum monococcum– ისგან დეგენერაციული დაშლით EcoO109I– ით, რომლის ამოცნობის ადგილები შედგებოდა 5'-PuGGNCCPy-3 'მრავალმიმდევრობით. სამი ახალი განმეორებითი თანმიმდევრობა pTm6, pTm69 და pTm58 A გენომიდან მიღებული იქნა სკრინინგი და ტესტირება მაღალი ასლის ნომრისთვის, დამცავი მიდგომის გამოყენებით. pTm6 აჩვენა იდენტურობა ქერის ინტეგრაციულ დომენებთან Ty1-Copia-retrotransposon BARE-1 ​​და pTm58 აჩვენა მსგავსება ქერის Ty3- ბოშათა მსგავსი რეტროტრანსპოზონის ბოშასთან. pTm69, თუმცა, წარმოადგენდა ტანდემურ მასივს სასარგებლო გენომური სპეციფიკით, მაგრამ არ იზიარებდა რაიმე ვინაობას ცნობილ განმეორებით ელემენტებთან. ეს კვლევა ასევე ცდილობდა ხორბლის D- გენომის სპეციფიკური განმეორებადი ელემენტების იზოლირებას მეთილაციის დონის მიუხედავად, გენომური გამოკლების გზით. Aegilops tauschii– ს მთლიანი გენომიკური დნმ მოწყვეტილი იქნა მოკლე ფრაგმენტებად მეთილილაციისადმი მგრძნობიარე 4 bp საჭრელით, MboI, და შემდეგ საერთო დნმ – ის თანმიმდევრობით Ae– ს შორის. tauschii და Triticum turgidum გამოაკლდა ზედმეტი T. turgidum გენომიკური დნმ -ით დაპრიალებით. D გენომის განმეორებითი თანმიმდევრობა pAt1 იყო იზოლირებული და გამოიყენებოდა ხორბლის ბაქტერიული ხელოვნური ქრომოსომებიდან დამატებითი ახალი სერიების განმეორებითი თანმიმდევრობის ოჯახისთვის, რომლის დიაპაზონია 1 395-1850 bp. მეთოდებმა წარმატებით განაპირობა ორი უნიკალური განმეორებითი ოჯახის გზა.


დნმ/რნმ მოპოვების რეაგენტები მცენარეთა კვლევაში

დნმ/რნმ -ის მოპოვება, როგორც წესი, პირველი ნაბიჯია მცენარეთა კვლევაში მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევების უმრავლესობისათვის. მცენარეები წარმოადგენენ ზოგიერთ უნიკალურ გამოწვევას ცხოველის ქსოვილებთან შედარებით დნმ/რნმ -ის მოპოვებაში. მაგალითად, მრავალი მცენარეული ქსოვილის მტკიცე უჯრედის კედელი ხშირად მოითხოვს შრომატევადი ფერმენტული ან მექანიკური ტექნიკის დაშლას. გარდა ამისა, სხვა პრობლემები შეიძლება შეგვხვდეს, მათ შორის დიდი რაოდენობით პოლისაქარიდების მაღალი შემცველობა RNases სხვადასხვა სახის ფენოლიკები, მათ შორის ტანინები ნუკლეინის მჟავების დაბალი შემცველობით (წყლის მაღალი შემცველობა), როგორიცაა ლიგნინი (ხე), რაც რთულია დაშლა და ასე შემდეგ. ამ პრობლემებისა და სირთულეების დასაძლევად, TransGen გთავაზობთ სილიციუმის დაფუძნებულ სპინ სვეტის მეთოდს და მოდიფიცირებულ CTAB მეთოდს, რომელიც მორგებულია მცენარის დნმ/რნმ-ის მოპოვებაზე. გარდა ამისა, ასევე შესაძლებელია ნიადაგის დნმ -ის მოპოვების რეაგენტი მაგნიტური მძივის მეთოდის საფუძველზე.

მცენარეთა დნმ-ის მოპოვება მცენარეთა კვლევაში-სილიციუმის დაფუძნებული დატრიალების სვეტის მეთოდი

სწრაფი სამუშაო ნაკადი და მაღალი პროდუქტიულობა (15 მკგ/100 მგ მცენარეული ქსოვილი).

პიგმენტის, პოლისაქარიდების, ფენოლების და სხვა მინარევების სრული მოცილება დნმ -ის შეკავშირების ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.

განაცხადის მონაცემები გამოქვეყნებიდან: ჟანგი Y, Li Z X, Yu X D და სხვ. ხორბალში ფარნეზილ პიროფოსფატის სინტაზას გენის ორი იზოფორმის მოლეკულური დახასიათება და მათი როლები სესკიტერპენის სინთეზში და აფუზიის შეჭრისგან დამცავი დაცვა [J]. ახალი ფიტოლოგი, 2015, 206 (3): 1101-1115.

ნახ. 1 Tafps- ის გენომიკური სტრუქტურა გამოვლინდა GSDS ანალიზის შემდეგ ხორბლიდან გენომიკური დნმ -ის ამოღების შემდეგ

EasyPure Lant მცენარეთა გენომიკური დნმ ნაკრები (კატა. No. EE111) .

მცენარეთა დნმ -ის მოპოვება მცენარეთა კვლევაში- მოდიფიცირებული CTAB მეთოდი

შესაფერისია პოლისაქარიდებითა და პოლიფენოლებით მდიდარი ნიმუშებისთვის.

განაცხადის მონაცემები გამოქვეყნებიდან: ჟანგ ლ, ლან ქ, ჰან ს და სხვები. GH3– ის მსგავსი გენი, LaGH3, იზოლირებული ჰიბრიდული ლარქიდან (Larix leptolepis × Larix olgensis) რეგულირდება აუქსინით და აბსცის მჟავით სომატური ემბრიოგენეზის დროს [J]. ხეები, 2019, 33 (6): 1723-1732.

ნახ. 2 LaGH3 გენის პრომოტორის რეგიონის სტრუქტურა, რომელიც მიიღება ბიოინფორმატიული ანალიზით გენომური დნმ -ის მოპოვების შემდეგ

დან L. leptolepis × L. olgensis გამოყენებით PlantZol (კატა. No. EE141), PCR და პრომოტორული რეგიონის კლონირება.

მცენარის რნმ -ის მოპოვება მცენარეთა კვლევაში-სილიკაზე დაფუძნებული დაწნული სვეტის მეთოდი

მაღალი სიწმინდე ცილის/დნმ -ის დაბინძურების გარეშე.

განაცხადის მონაცემები გამოქვეყნებიდან: ლიუ Q, დენგ S, Liu B და სხვები. ჰელიტრონით გამოწვეული RabGDIα ვარიანტი იწვევს რაოდენობრივ რეცესიულ წინააღმდეგობას სიმინდის უხეში ჯუჯა დაავადების მიმართ [J]. ბუნების კომუნიკაციები, 2020, 11 (1): 1-14.

ნახ. 3 ტრანსგენური მცენარეები, რომლებიც გამოხატავს ეგზოგენურ ZmGDIα გენს, დადასტურდა RT-PCR ექსპერიმენტებით

მთლიანი რნმ ამოღებულია სიმინდის ფოთლის გამოყენებით EasyPure Lant მცენარეთა RNA ნაკრები (კატა. No. ER301) .

მცენარის რნმ -ის მოპოვება მცენარეთა კვლევაში-შეცვლილი CTAB მეთოდი

შესაფერისია პოლისაქარიდებით და პოლიფენოლებით მდიდარი ნიმუშებისთვის, როგორიცაა შამპინიონი, ბანანის ხილი, მანგოს ხილი, კარტოფილის ტუბერები, სტაფილო, ვეფხვის პირანის ფოთოლი და ა.

განაცხადის მონაცემები გამოქვეყნებიდან: ტანგ გ, სინგ ს, ვანგ ს და სხვები. ცისტეინის ნარჩენების რეგულირება LsrB ცილებში Sinorhizobium meliloti– დან თავისუფალი სიცოცხლის და სიმბიოტური ჟანგვითი სტრესის ქვეშ [J]. გარემოს მიკრობიოლოგია, 2017, 19 (12): 5130-5145.

ნახ. 4 lsrB, lrp3, katA და gshA გამოხატვა იონჯის კვანძებში, რომელიც გამოვლენილია qRT-PCR ანალიზით ძირეული კვანძებიდან

იონჯის 20 ორკვირიანი მცენარე დამუშავდა რნმ-ის მოპოვებით ტრანსზოლი მცენარე (კატა. No. ET121).

ნიადაგის დნმ -ის მოპოვება მცენარეთა კვლევაში-შეცვლილი CTAB მეთოდი

მარტივი და სწრაფი

მაღალი მოსავალი და სიწმინდე

მდინარისპირა ქვიშის ნიადაგი 1 მდინარისპირა ქვიშის ნიადაგი 2 მდინარისპირა ქვიშის ნიადაგი 3 სახნავი ნიადაგის ნიმუში

ნახ. 5 აგაროზის გელის ელექტროფორეზი აჩვენებს გენომურ დნმ -ს, რომელიც ამოღებულია 250 მგ სხვადასხვა ტიპის ნიადაგის ნიმუშებიდან.

MagicPure ® განავლისა და ნიადაგის გენომიკური დნმ ნაკრები (კატა. No. EC801) და პროდუქტი კომპანია T- დან, შესაბამისად.

Tamari F, Hinkley C S. მცენარეული ქსოვილიდან დნმ -ის მოპოვება: მიმოხილვა და პროტოკოლები [M] // ნიადაგის, მცენარეთა და ცხოველთა ნიმუშების ნიმუშის მომზადების ტექნიკა. ჰუმანა პრესი, ნიუ-იორკი, ნიუ-იორკი, 2016: 245-263.

Yockteng R, Almeida A M R, Yee S, et al. მეთოდი მრავალფეროვანი მცენარეებიდან მაღალი ხარისხის რნმ -ის მოპოვებისათვის მომავალი თაობის თანმიმდევრობისა და გენის გამოხატვის ანალიზისათვის [J]. პროგრამები მცენარეთა მეცნიერებებში, 2013, 1 (12): 1300070.

დაკავშირებული გვერდები დნმ/რნმ -ის მოპოვების რეაგენტებისთვის მცენარეთა კვლევაში


გენომური დნმ იზოლაცია ხორბლისგან - ბიოლოგია

ბირთვების იზოლაცია

სიფრთხილე: ატარეთ შესაბამისი დამცავი ტანსაცმელი და მიიღეთ უსაფრთხოების შესაბამისი ზომები ადამიანის სისხლთან მუშაობისას.

  1. 5 მლ მთლიანი სისხლი (შეიცავს EDTA როგორც ანტიკოაგულანტი) 15 მლ პოლიპროპილენის ცენტრიფუგა მილში.
    Შენიშვნა: ფრინველის სისხლით ან სხვა სახეობების სისხლით, რომლებსაც აქვთ ბირთვიანი სისხლის წითელი უჯრედები, გამოიყენეთ 0.2 მლ სისხლი და 4.8 მლ 1x Tris-Buffered Saline (TBS, 50 mM Tris-Cl, 200 mM NaCl, 3 mM KCl, 0.02% Sodium) აზიდი, pH 7.5) 5 მლ სისხლის ნაცვლად.
  2. დაამატეთ 5 მლ 2x ლიზის ბუფერი (0.65 მ საქაროზა, 20 მლ Tris-Cl, pH 7.8, 10 მმ MgCl2, 2% Triton X-100) და აურიეთ ნაზი ინვერსიით.
  3. Incubate solution for 5 minutes on ice.
  4. Pellet nuclei by centrifugation at 1000 x g for 12 minutes at 4C.
  5. Decant supernatant and drain any residual supernatant by inverting the tube on a paper towel for 2 minutes.
    Შენიშვნა: The pelleted nuclei may be stored at 70C for several weeks at this point, however, higher molecular weight DNA is obtained when genomic DNA is isolated from freshly prepared nuclei.

At this point, the DNA should have been extracted with both Phenol and Phenol-Chloroform and should be in a clean 15 ml polypropylene screw cap centrifuge tube.

  1. Add 100 l 2 M KCI and mix by gentle inversion.
  2. Overlay DNA solution with 5 ml 95% Ethanol by slowly pipetting the Ethanol down the side of the tube.
  3. Place a Pasteur pipet tip at the interface of the DNA-Ethanol solution and spool the DNA onto the pipet tip by swirling the pipet, keeping the tip at the interface, until the 2 phases are completely mixed.
  4. Place pipet tip with the spooled DNA in 1 ml 70% Ethanol for about 2 minutes.
  5. Remove pipet from the 70% Ethanol and hold upright (tip up) for a few seconds to allow the excess Ethanol to drain away. Do not allow the DNA to dry.
  6. Set pipet tip in a microcentrifuge tube containing 200 l TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and incubate f or 20 minutes at room temperature. The DNA should slide from the pipet into the TE. If necessary, gently remove the DNA from the pipet by scraping the DNA onto the interior of the tube.
  7. Redissolve DNA completely by incubating overnight at 4C. Store DNA at 4C. Do not freeze.
  1. Herrmann, B.G. and Frischauf, A.M. (1987) Isolation of genomic DNA. Methods Enzymol. 152:180-183.
  2. Laws, G.M. and S.P. Adams. (1996) Measurement of 8-OHdG in DNA by HPLC/ECD: The importance of DNA purity. BioTechniques 20:36-38.
  3. Murphy, N.R. and Hellwig, R. J. (1996) Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier matrix. BioTechniques 21:934-939.

წყარო:


Page: All 1 2 3 4
Related biology technology :


Ancient Wheat Genome Reveals Clues to the Agricultural Past

Jef Akst
Mar 1, 2020

A s soon as he learned about the existence of ancient wheat specimens at University College London’s Petrie Museum of Egyptian Archaeology from a 2018 BBC documentary, Richard Mott of the UCL Genetics Institute wanted to study them. The samples likely contained bits of ancient wheat DNA, he reasoned, which could yield valuable insights into the history of cultivation of this all-important crop species.

Archaeobotanists at UCL helped Mott and a team of collaborators choose a handful of well-preserved husks from the museum’s collection of ancient emmer wheat, a variety native to the Near East and one of the first crops to be domesticated in the region, from which the researchers selected two husks for DNA extraction. After carefully removing the husks from the box, photographing them, and wrapping them in foil, the scientists transported the centuries-old plant material to a freshly bleached cleanroom used exclusively to process ancient and forensic samples.

It’s fascinating to see this gene flow happening in an area important for human history.

There, team member Laura Botigué, a population geneticist and visiting researcher from the Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG) in Barcelona, Spain, donned a hairnet, two Tyvek suits, two pairs of latex gloves, and a mask—part of a protocol designed to avoid contaminating the samples with her own cells. Uncertain how the delicate husks would hold up to the standard decontamination protocol of bleaching the samples, Botigué bleached one and left the second untouched. Then, to lyse the plant’s cells, she put the samples in a rotator that gently shook the husks inside an oven over the next several days. Finally, she used a centrifugation protocol to separate any DNA from the degraded cell walls and proteins.

Once the samples had been prepped and delivered to the UCL Genomics facility for sequencing, it was a waiting game to see if the procedure had yielded any readable wheat DNA. “This is the more stressful part,” Botigué says. Because they lack the type of protective collagen matrix found in bones, plants don’t preserve ancient DNA as well as animals. “You finish, the DNA is theoretically extracted, but you don’t see it in the tube,” says Botigué. “You’re in the blind until you hear back from the sequencing services.”

Within just a few weeks, the team got good news. For the husk that Botigué had bleached, about two-thirds of the reads aligned with genomes of modern wild and domesticated emmer wheat varieties—a relatively good success rate for ancient DNA, according to evolutionary geneticist Michael Scott, a postdoc in Mott’s lab who conducted the bioinformatics analysis of the sequences. “The first surprise was how well it worked,” he says. “It appears that the dry conditions in Egypt were good for DNA preservation.” The unbleached husk had yielded a smaller quantity of sequences, but those fragments mostly matched the ones in the bleached sample, validating the identity of those sequences as coming from the ancient wheat samples rather than from contaminants.

The museum wheat, which carbon dating showed was from between 1130 and 1000 BC, was genetically much more similar to modern domesticated varieties than to modern wild ones, suggesting that the plant lineage the samples came from had already been domesticated. Specifically, the sequences most resembled those of modern domesticated strains grown in Turkey, Oman, and India. There was also evidence for genetic exchange between the museum wheat strain and the wild emmer wheat that grew in the Levant, a large region in the Eastern Mediterranean that was a center of agricultural development in the Neolithic period, and where emmer was first cultivated. The genetic exchange could have occurred before the wheat’s introduction to Egypt from the Levant, says Scott. Alternatively, it’s possible that the ancient Egyptians’ wheat was able to interbreed with wild wheat in the Southern Levant thanks to interactions between the people in the two regions.

“With big data and with a really good analysis method they were able to detect this gene flow,” says M. Timothy Rabanus-Wallace, an agricultural geneticist at the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research in Germany who coauthored a perspective published alongside the study in Nature Plants last October. “It’s fascinating to see this gene flow happening . რა რა in an area important for human history.”

See “Confessing to Plant Blindness”

The bioinformatics analysis also uncovered some genetic variants in the ancient samples that weren’t found in any of the modern emmer wheat genomes the researchers studied. If these variants helped the wheat survive in arid locations around the Near East, perhaps introducing those sequences into modern varieties could help make them more sustainable or more drought resistant, Scott says, though he admits that this “is very much just an idea.”

The detection of ancient genetic variation is a notable achievement because wheat genomes are large—three to five times the length of a human genome—and repetitive, making the “analysis . რა რა incredibly complex,” says James Breen, head of the bioinformatics core at the South Australian Health and Medical Research Institute who reviewed the study and coauthored the perspective with Rabanus-Wallace, a PhD student in his lab at the Australian Centre for Ancient DNA at the time. “So being able to find unique pieces of DNA in that genome is very difficult.” He adds that after a couple of additional validation tests performed by the UCL team, he was convinced that “the data that came out was legitimately ancient.”

Botigué and Scott emphasize that the study is primarily a proof of concept that museum-kept plant samples can yield readable genetic material. “We were able to look at DNA from specimens that had been stored in the museum for over 90 years without special preservation conditions—the museum was actually even bombed and flooded during wartime,” says Scott. “We think our study helps demonstrate the importance of museum collections as sources of genetic data, which”—in combination with new samples—“can be used to uncover the history of selection on crops and their movement around the globe.”

See “The Narluga: New Insights from Old Bones”

“I think that’s one of the biggest values of ancient DNA in plants,” adds Nathan Wales, an archaeologist at the University of York who was not involved in Scott and Botigué’s study—“to draw connections between different cultures and the different agricultural products they were growing and trading, and seeing how that changed over time.”


  • Store RNase A and Proteinase K at -20°C.
  • Add ethanol (&ge 95%) to the gDNA Wash Buffer concentrate as indicated on the bottle label.
  • Set a thermal mixer (e.g. ThermoMixer ® ) or, if not available, a heating block to 56°C for sample lysis.
  • Set a heating block to 60°C. Preheat the appropriate volume of elution buffer to 60°C (35-100 &mul per sample).
  • Do not load a single column with the lysed sample more than once over-exposure of the matrix to the lysed sample can cause the membrane to expand and dislodge.

PART 1: Sample Lysis

PART 2: Genomic DNA Binding and Elution

PART 1: SAMPLE LYSIS

Cultured Cells:

    Start with a cell pellet containing 1 x 10 4 &ndash 5 x 10 6 cells (typical starting amount is 1 x 10 6 cells).

Frozen cells: thaw cell pellet slowly on ice and loosen by flicking the tube several times. Resuspend in 100 &mul cold PBS by pipetting up and down.

Fresh cells: pellet by centrifugation at 1000 x g for 1 minute and resuspend in 100 &mul cold PBS by pipetting up and down.

Ensure pellet is resuspended completely. If using lower cell inputs, the use of carrier RNA may be beneficial see product manual for details.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA. If a thermal mixer is not available, use a heating block and vortex occasionally.

Mammalian Whole Blood (non-nucleated)

    Transfer 100 &mul of whole blood to a 1.5 ml microfuge tube. If processing less than 100 &mul of blood, add cold PBS to bring the total volume to 100 &mul. For pre-aliquoted frozen samples, do not thaw add Proteinase K, RNase A and Blood Lysis Buffer to the frozen sample in step 2.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA from most species. If a thermal mixer is not available, use a heating block and vortex occasionally.

Nucleated Whole Blood (birds, reptiles)

    Transfer 10 &mul whole blood to a 1.5 ml microfuge tube.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA.

Animal Tissue

  1. Cut tissue into small pieces to ensure rapid lysis and high yields. Weigh the appropriate tissue amount and place in a 1.5 ml microfuge tube (see table below or Choosing Input Amounts for recommended input amounts)
    STARTING MATERIALRECOMMENDED INPUT AMOUNT
    Rodent tailup to 25 mg
    Brainup to 12 mg
    Fibrous tissue (muscle, heart)up to 25 mg
    Ear clips, skinup to 10 mg
    Liver, lungup to 15 mg
    Spleen, kidneyup to 10 mg
  2. Add Proteinase K (according to the table below) and 200 &mul of Tissue Lysis Buffer to each sample. Mix immediately by vortexing. Ensure tissue particles are able to move freely in the lysis mix and do not remain stuck on the bottom of the tube. When working with multiple samples, prepare a master mix of Tissue Lysis Buffer and Proteinase K to save pipetting steps.
    TISSUE TYPEPROTEINASE K AMOUNT
    Brain, Kidney, Skin, Ear Clips3 &mul
    All other tissues10 &mul
  3. Incubate at 56°C in a thermal mixer with agitation at full speed (1400 rpm) until tissue pieces have completely dissolved (typically 30-60 minutes). If time is not limiting, additional incubation up to 3 hours can further improve yields and decrease residual RNA. If an incubator with agitation is not available, use a tube rotator placed within an incubator, shaking water bath or a heating block (vortex samples every 5-15 minutes to speed up lysis).

PART 2: GENOMIC DNA BINDING AND ELUTION

  1. Add 400 &mul gDNA Binding Buffer to the sample and mix thoroughly by pulse-vortexing for 5-10 seconds. Thorough mixing is essential for optimal results.
  2. Transfer the lysate/binding buffer mix (

20&ndash40% and eliminates the need for a second elution. For applications in which a high DNA concentration is required, using a small elution volume and then eluting again with the eluate may increase yield (


შესავალი

Puccinia triticina, the causal organism for leaf rust in wheat is a biotrophic pathogen. Hence its urediniospores cannot be grown artificially in culture media, ე.ი., outside its living host. So, samples needed for RNA isolation had to be collected from infected plants, which often was a mixture of both host and pathogen RNA. An efficient RNA isolation method from Puccinia spores became necessary when high amount and good quality of RNA is required for strain identification, polymerase chain reaction (PCR)-based studies or small RNA library preparation. Earlier research on pathogen-derived sequences relied mostly on in silico methodologies based on transcriptome or genomic data analysis (Kiran et al., 2016 Kumar et al., 2017 Dutta et al., 2017). Validation of pathogen sequences were not possible due to unavailability of suitable technique for isolation of good quality RNA from pathogen spores.

Several methods exist for successful isolation of RNA from different plant and animal tissues, a basic requirement for most molecular biology studies (Tan and Yiap, 2009). Earlier, to obtain RNA free of DNA was a tedious task even after the introduction of Guanidinium thiocyanate in extraction buffers. Later with the development of Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, which combines multiple steps, made RNA isolation comparative easy (Chomczynski and Sacchi, 2006 Sambrook and Russel, 2001). Other methods, quite different from the conventional methods, were also developed like chromatography on oligo (dT) columns or magnetic oligo (dT) beads to specifically separate poly (A) containing RNA.

These different techniques developed for RNA isolation using conventional or kit-based methods (Peng et al., 2007) are applicable for a wide range of plant and animal tissues. A few kits are available for yeast cells also, but no method suitable for spores like urediniospores with very hard and tough cell wall are available. Spores have tough cell wall. Therefore, RNA isolation using urediniospores primarily needs a proper technique for cell lysis. A recent report on RNA isolation from Puccinia striiformis urediniospores compared several techniques using low cost reagents and the authors suggested a NaCl-based method as the most appropriate for extracting RNA (Li-Jie et al., 2016). But the method required adequate amounts (minimum 0.1 g) of spores to be pulverized in liquid nitrogen using mortar and pestle which is commonly associated with sample loss during transfer processes. In the present study, a method for rapid RNA isolation was developed which requires minuscule quantity of spores but yields good quantity and high quality of RNA that could be used for almost all molecular biology studies.


Isolation of Genetic Materials

The knowledge of gene isolation was developed after gaining the concept of physical and chemical characteristics of described DNA fragments their sizes, shapes and conformation can aid in the selection of methods used to isolate and purify those segments.

Plants provide several special challenges for researchers interested in the recombinant DNA research. No other class of living organisms has three separate genomes to analyze a nuclear genome containing high molecular weight linear chromosomes, a circular mitochondrial genome, and a circular chloroplast genome. Intact, high molecular weight (>150kbp) plant nuclear gDNA is used to construct genomic DNA libraries and to probe the plant genome for the presence of DNA markers, such randomly amplified polymorphic DNAs (RAPDs) and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). Chloroplast cpDNA and mitochondrial mtDNA, which are thought to incur fewer structural changes over time, are often used to study plant systematic. They are also used to study in vitro synthesis and assembly of organelle proteins.

Isolating the DNA (Gene) for interest

For isolation of DNA from linear chromosomes of living organisms like plants, animals or from simple bacteria, it is necessary to break the cell for release of DNA which may be done by physical (homogenization or pressure), or biochemical means like solubilization with detergents or enzymes. The selection of enzyme for this process is dependent on the composition of the Particular cells that are used for plant materials, for fungal sample, chitinase is used.

Lysozyme is commonly used for both bacterial and animal tissue samples. The DNA so obtained is then separated from the cell walls, membranes, and other cellular debris by means of centrifugation, often followed by density gradient centrifugation. The localization of DNAs is the gradient may be done by instrumental method (absorption at 260 nm or visually by means of fluorescence). The isolation of DNA is done by inserting a syringe into the side of the soft plastic centrifuge tube and withdrawing the bands visible in UV radiation. The isolated DNA may be further purified and physically characterized (for example, for size) by means of electrophoresis in gel made up of agarose or of acryl amide.

Isolation of genes is the in vitro gene manipulation as it gives us the ability to bypass the multiplicity of mechanisms that restrict gene transfer between unrelated organisms and are far more accurate and subtle in nature. The broad outlines of this technique is: isolation of gene of interest, insertion of a gene into an appropriate vector, transfer of foreign DNA (gene) through the vector into an appropriate host organism to produce recombinant DNA and identification of recombinants.

DNA Isolation Methods

Many different methods and technologies are available for the isolation of genomic DNA. In general, all methods involve disruption and lysis of the starting material followed by the removal of proteins and other contaminants and finally recovery of the DNA. Removal of proteins is typically achieved by digestion with proteinase K, followed by salting-out, organic extraction, or binding of the DNA to solid-phase support (either anion-exchange or silica technology).DNA is usually recovered by precipitation using ethanol or isopropanol. The choice of a method depends on many factors: the required quantity and molecular weight of the DNA, the purity required for downstream applications, and the time and expense.

The separation of DNA from cellular components can be divided into four stages:

  1. Disruption
  2. Lysis
  3. Removal of proteins and contaminants
  4. Recovery of DNA

Preparation of crude lysates

An easy technique for isolation of genomic DNA is to incubate cell lysates at high temperatures (e.g., 90°C for 20 minutes), or to perform a proteinase K digestion, and then use the lysates directly in downstream applications. Considered “quick-and-dirty” techniques, these methods are only appropriate for a limited range of applications. The treated lysate usually contains enzyme inhibiting contaminants, such as salts, and DNA is often not at optimal pH. Furthermore, incomplete inactivation of proteinase K can result in false negative results and high failure rates. It is not recommended to store DNA prepared using this method, as the high levels of contamination often result in DNA degradation.

Salting-out methods

Starting with a crude lysate, ”salting-out” is another conventional technique where proteins and other contaminants are precipitated from the cell lysate using high concentrations of salt such as potassium acetate or ammonium acetate. The precipitates are removed by centrifugation, and the DNA is recovered by alcohol precipitation. Removal of proteins and other contaminants using this method may be inefficient, and RNase treatment, dialysis, and/or repeated alcohol precipitation are often necessary before the DNA can be used in downstream applications. DNA yield and purity are highly variable using this method.

Organic extraction methods

Organic extraction is a conventional technique that uses organic solvents to extract contaminants from cell lysates. The cells are lysed using a detergent, and then mixed with phenol, chloroform, and isoamyl alcohol. The correct salt concentration and pH must be used during extraction to ensure that contaminants are separated into the organic phase and that DNA remains in the aqueous phase. DNA is usually recovered from the aqueous phase by alcohol precipitation. This is a time consuming and cumbersome technique. Furthermore, the procedure uses toxic compounds and may not give reproducible yields. DNA isolated using this method may contain residual phenol and/or chloroform, which can inhibit enzyme reactions in downstream applications, and therefore may not be sufficiently pure for sensitive downstream applications such as PCR. The process also generates toxic waste that must be disposed of with care and in accordance with hazardous waste guidelines. In addition, this technique is almost impossible to automate, making it unsuitable for high-throughput applications.

Cesium chloride density gradients

Genomic DNA can be purified by centrifugation through a cesium chloride (CsCl) density gradient. Cells are lysed using a detergent, and the lysate is alcohol precipitated. Resuspended DNA is mixed with CsCl and ethidium bromide and centrifuged for several hours. The DNA band is collected from the centrifuge tube, extracted with isopropanol to remove the ethidium bromide, and then precipitated with ethanol to recover the DNA. This method allows the isolation of high-quality DNA, but is time consuming, labor intensive, and expensive (an ultracentrifuge is required), making it inappropriate for routine use. This method uses toxic chemicals and is also impossible to automate.

Fragmentation by Mechanical Shearing:

Random fragments of DNA can be generated by mechanical shearing. The desired fragments obtained by this method are without cohesive ends therefore, the ligation (joining) with the vector can be facilitated with a process known as homopolymer tailing. For example, a tail of dC residues (deoxynucleotide triphosphate) can be added to 3-OH terminus of DNA of sheared fragment and a tail of dG residues vector. The fragments to be cloned can then be joined to the reactor by annealing the tails.

Short- Gun method:

There is a restriction enzyme which is specific for a six-base sequence of DNA. It is used to cut foreign DNA to get a piece of interest. One can obtained fragments of 3 to 4 genes by this method, if distribution of bases is random. The fragments obtained can be too small or too big if the no of cutting sites recognized by enzyme used are too frequent and too sparse in the distribution. It is also important that is cutting sites falls on either end of gene of interest and not in between. When the same enzyme is used to cut the vector DNA, cohesive ends are created, in most cases depending on the nature of enzyme, the joining of vector and the isolated DNA is possible.

Shotgun Sequencing

cDNA method:

If animal gene is to be expressed in a bacterium or yeast, a suitable method is to isolate the messenger RNA (mRNA), first, concerned with the specific protein production. It is often impossible to express animal gene directly in bacteria because of the introns within the gene. The protein encoding parts of the genes are exons. Mature mRNA molecules in animals cells do not contain sequences complementary to introns as they are removed by processing. Introns are the sequences in DNAs which are in fact transcribed into mRNAs but are subsequently split out are therefore form no permanent consequents of the mRNAs (only reverse transcriptase and DNA polymerase. Thus cDNA produced for a particular product can be then joined to the appropriate vector for cloning by homopolymer tailing as described above or proper linkers.


ASJC Scopus subject areas

  • APA
  • Standard
  • Harvard
  • Vancouver
  • Author
  • BIBTEX
  • RIS

Research output : Contribution to journal › Article › peer-review

T1 - Isolation of a D-genome specific repeated DNA sequence from Aegilops squarrosa

N2 - Three repeated sequence clones, pAS1(1.0 Kb), pAS2(1.8 Kb) and pAS12(2.5 Kb), were isolated from Aegilops squarrosa (Triticum tauschii). The inserts of the three clones did not hybridize to each other. Two of the clones, pAS2 and pAS12, contain repeated sequences which were distributed throughout the genome. The clone pAS1 sequence was more restricted and was located in specific areas on telomeres and certain interstitial sites along the chromosome length. This cloned sequence was also found to be restricted to the D genome at the level of in situ hybridization. The pAS1 sequence will be useful in chromosomal identification and phylogenetic analysis. All three clones will allow assessment of genome plasticity in Aegilops squarrosa. Nuclear DNA content varies over a range of 10,000 fold among all organisms (Nagl et al., 1983). Among angiosperms, at least a 65-fold range in genome size occurs in diploid species (Sparrow, Price and Underbrink, 1972 Bennett, Smith and Heslop-Harrison, 1982). This DNA variation has been reported within families, genera, and species (Rothfels et al., 1966 Rees and Jones, 1967 Miksche, 1968 Price, Chambers and Bachmann, 1981). Much of the interspecific variation in genome size among angiosperms appears to be due to amplification and/or deletion of DNA within chromosomes. The variation in genome size does not appear to result in changes in the number of coding genes (Nagl et al., 1983). While the number of coding genes, with the exception of rDNA in specific examples, appears to remain constant, the remaining non-coding regions are quite flexible. This non-coding DNA encompasses over 99% of the plant genome and consists of sequences that exist as multiple copies throughout the genome and are identified as repeated DNA sequences (Flavell et al., 1974). Flavell et al. (1974) have reported that increasing genome size in higher plants is associated with increasing repetitive DNA amounts. Subsequent reports have substantiated this correlation (Bachmann and Price, 1977 Narayan, 1982). In various cereals, heterochromatin, which has been demonstrated to be correlated with the location of specific repeated DNA sequences, has been positively correlated with genome size (Bennett, Gustafson and Smith, 1977 Rayburn et al., 1985). Furuta, Nishikawa and Makino (1975) found significant DNA content variation among different accessions of Aegilops squarrosa L. This species contains the D genome, a pivotal genome in several polyploid species and also found in hexaploid wheat (AABBDD). The importance of this genome to the study of bread wheat genomes makes the mechanism(s) of this genomic plasticity of particular interest. In order to determine which sequences are varying, one must first have a way to identify specific types of chromatin and/or DNA. Specific types of chromosome banding such as C- and N-banding have been used to identity types of chromatin in previous studies. C-banding of the D genome results in very lightly staining bands whose pattern is somewhat indistinct. N-banding alternatively has been shown to be useful in identifying certain chromosomes of hexaploid wheat but is limited by the lack of major bands in the D genome (Endo and Gill, 1984). Specific DNA sequences have been isolated from Triticum aestivum cultivar "Chinese Spring" (hexaploid wheat). However, these sequences are representatives of the A and/or B genomes of hexaploid wheat and are not found in significant quantities in the D genome (Hutchinson and Lonsdale, 1982). Various other repeated DNA sequences have been successfully isolated from rye (Bedbrook et al., 1980) and identified on rye chromosomes (Appels et al., 1981 Jones and Flavell, 1982). Certain of these sequences are found in wheat genomes, but the sequences are representative of only a minor fraction of the D genome (Bedbrook et al., 1980 Rayburn and Gill, 1985). The purpose of this report is to describe three distinct repeated DNA sequences isolated from A. squarrosa (D genome). Two clones appear to be distributed throughout the total genome, and the third clone is restricted to specific sites along the chromosomes. This latter clone will prove useful in cytologically defining the D genome chromosomes. These sequences appear representative of two types of repeated DNA genome organization: 1) sequences distributed throughout the genome and 2) specific arrays of repeated sequences. The availability of such repeated DNA sequence clones along with the known intraspecific DNA content variation in A. squarrosa will allow the study of genomic plasticity of this species.

AB - Three repeated sequence clones, pAS1(1.0 Kb), pAS2(1.8 Kb) and pAS12(2.5 Kb), were isolated from Aegilops squarrosa (Triticum tauschii). The inserts of the three clones did not hybridize to each other. Two of the clones, pAS2 and pAS12, contain repeated sequences which were distributed throughout the genome. The clone pAS1 sequence was more restricted and was located in specific areas on telomeres and certain interstitial sites along the chromosome length. This cloned sequence was also found to be restricted to the D genome at the level of in situ hybridization. The pAS1 sequence will be useful in chromosomal identification and phylogenetic analysis. All three clones will allow assessment of genome plasticity in Aegilops squarrosa. Nuclear DNA content varies over a range of 10,000 fold among all organisms (Nagl et al., 1983). Among angiosperms, at least a 65-fold range in genome size occurs in diploid species (Sparrow, Price and Underbrink, 1972 Bennett, Smith and Heslop-Harrison, 1982). This DNA variation has been reported within families, genera, and species (Rothfels et al., 1966 Rees and Jones, 1967 Miksche, 1968 Price, Chambers and Bachmann, 1981). Much of the interspecific variation in genome size among angiosperms appears to be due to amplification and/or deletion of DNA within chromosomes. The variation in genome size does not appear to result in changes in the number of coding genes (Nagl et al., 1983). While the number of coding genes, with the exception of rDNA in specific examples, appears to remain constant, the remaining non-coding regions are quite flexible. This non-coding DNA encompasses over 99% of the plant genome and consists of sequences that exist as multiple copies throughout the genome and are identified as repeated DNA sequences (Flavell et al., 1974). Flavell et al. (1974) have reported that increasing genome size in higher plants is associated with increasing repetitive DNA amounts. Subsequent reports have substantiated this correlation (Bachmann and Price, 1977 Narayan, 1982). In various cereals, heterochromatin, which has been demonstrated to be correlated with the location of specific repeated DNA sequences, has been positively correlated with genome size (Bennett, Gustafson and Smith, 1977 Rayburn et al., 1985). Furuta, Nishikawa and Makino (1975) found significant DNA content variation among different accessions of Aegilops squarrosa L. This species contains the D genome, a pivotal genome in several polyploid species and also found in hexaploid wheat (AABBDD). The importance of this genome to the study of bread wheat genomes makes the mechanism(s) of this genomic plasticity of particular interest. In order to determine which sequences are varying, one must first have a way to identify specific types of chromatin and/or DNA. Specific types of chromosome banding such as C- and N-banding have been used to identity types of chromatin in previous studies. C-banding of the D genome results in very lightly staining bands whose pattern is somewhat indistinct. N-banding alternatively has been shown to be useful in identifying certain chromosomes of hexaploid wheat but is limited by the lack of major bands in the D genome (Endo and Gill, 1984). Specific DNA sequences have been isolated from Triticum aestivum cultivar "Chinese Spring" (hexaploid wheat). However, these sequences are representatives of the A and/or B genomes of hexaploid wheat and are not found in significant quantities in the D genome (Hutchinson and Lonsdale, 1982). Various other repeated DNA sequences have been successfully isolated from rye (Bedbrook et al., 1980) and identified on rye chromosomes (Appels et al., 1981 Jones and Flavell, 1982). Certain of these sequences are found in wheat genomes, but the sequences are representative of only a minor fraction of the D genome (Bedbrook et al., 1980 Rayburn and Gill, 1985). The purpose of this report is to describe three distinct repeated DNA sequences isolated from A. squarrosa (D genome). Two clones appear to be distributed throughout the total genome, and the third clone is restricted to specific sites along the chromosomes. This latter clone will prove useful in cytologically defining the D genome chromosomes. These sequences appear representative of two types of repeated DNA genome organization: 1) sequences distributed throughout the genome and 2) specific arrays of repeated sequences. The availability of such repeated DNA sequence clones along with the known intraspecific DNA content variation in A. squarrosa will allow the study of genomic plasticity of this species.