ინფორმაცია

Taq პოლიმერაზის სტაბილურობა მაღალ ტემპერატურაზე


დამისვეს შეკითხვა, თუ რა არის განსაკუთრებული ტაკ პოლიმერაზას, რაც მას საკმაოდ სტაბილურს ხდის მაღალ ტემპერატურაზე, თუმცა მისი ფუნქციონირება იგივეა, რაც სხვა დნმ პოლიმერაზებს, როგორც მეზოფილებს.

მე უბრალოდ ვფიქრობ, რომ ეს არის კონკრეტული ბაქტერიების ადაპტაცია იმ მაღალ ტემპერატურაზე. მაგრამ მე მინდა ვიცოდე, არის თუ არა რაიმე ძლიერი მიზეზი ამ სტაბილურობისთვის.


ევოლუციური მიზეზი არის ის, რაც თქვენ ახსენეთ: თაკის თერმოსტაბილურობამ მის ბაქტერიას საშუალება მისცა კოლონიზაცია მოახდინოს მაღალი ტემპერატურის გარემოში. თუმცა, ეს არაფერს ამბობს ამ განსხვავების მოლეკულურ მიზეზებზე.

ეს ძალიან კარგი პასუხი ვიპოვე Quora– ში. პოსტის ბოლოს აქვს რამდენიმე მითითება მის პრეტენზიებზე.

მოკლედ რომ ვთქვათ, ცილების დაკეცილი მდგომარეობის სტაბილურობა დამოკიდებულია თავისუფალი ენერგიის განსხვავებაზე $ დელტა G $ დაკეცილ და გაშლილ მდგომარეობას შორის. თუმცა, $ Delta G = Delta H - T Delta S $რაც ნიშნავს, რომ თავისუფალი ენერგიის სხვაობა შეიძლება იყოს ენთალპიის უფრო დიდი სხვაობისგან (მაგალითად, მარილის ხიდები, წყალბადის ობლიგაციები, ჰიდროფობიური ურთიერთქმედება და სხვა დაკეცილ მდგომარეობაში) ან ენტროპიის მცირე სხვაობა (მაგალითად, მცირე რაოდენობის "არა მკაცრი" ამინომჟავები, როგორიცაა გლიცინი, ან წყლის მაღალი გამოშვება დასაკეციდან).

მიუხედავად იმისა, რომ ენთალპია ხშირად არის დასაკეცი სტაბილურობის მიზეზი, როგორც ჩანს, თაკ პოლიმერაზასთვის განსხვავება რეალურად მდგომარეობს ენტროპიის უჩვეულოდ მცირე განსხვავებაში ორ მდგომარეობას შორის.

რედაქტირება: აქ არის პოსტის ერთ -ერთი საუკეთესო მითითება. გახსენით ბმული ზემოთ, რომ ნახოთ მეტი. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24174290


თერმოსტაბილი დნმ პოლიმერაზების გამწმენდი

თერმოსტაბილი პოლიმერაზები, რა თქმა უნდა, მოლეკულური ბიოლოგიის მთავარი ხელშემწყობია, პოლიმერაზული ჯაჭვურ რეაქციაში (PCR) მათი სარგებლიანობის გამო. დღეს მე ვაჩვენებ იმ პროცესს, რომლითაც ხდება ამ მნიშვნელოვანი ფერმენტების იზოლირება. თქვენ ისწავლით თუ როგორ უნდა შექმნათ თქვენი საკუთარი Taq პოლიმერაზა ღია კოდის გამოხატვის ვექტორის გამოყენებით pOpenTaq, ასევე გააცნობიერებთ Gene And Cell Technologies– ის მიერ შემოთავაზებული კომერციული პოლიმერაზების სიწმინდის ხარისხს. ამ ბლოგის პოსტში ასახული პრინციპები უნდა მოქმედებდეს ნებისმიერი თერმოსტაბილური ნუკლეინის მჟავის პოლიმერაზაზე.

Taq პოლიმერაზა შეიძლება გამოიხატოს pOpenTaq, ღია კოდის პოლი პოლიმერაზას გამომსახველი პლაზმიდით. pOpenTaq უნდა გარდაიქმნას E. coli BL21 შტამად და გამოწვეული იყოს 1 მმ IPTG– ით სტანდარტული პროტოკოლების გამოყენებით. ღამით გამოხატვა გაზრდის მოსავალს. ცილის 100% გამოითვლება ხსნადი ფორმით 37 ° C ტემპერატურაზე.

ჩვენი გამწმენდი სტრატეგია იქნება:


ტაკ პოლიმერაზის სტაბილურობა მაღალ ტემპერატურაზე - ბიოლოგია

არასასურველი პირობებისადმი ყველაზე მგრძნობიარე კომერციული მასტერ მასალის კომპონენტი არის პოლიმერაზა. კომერციული პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) ძირითადი ნარევები ზოგადად რეკომენდირებულია storage20 ° C ტემპერატურაზე შესანახად, წინააღმდეგ შემთხვევაში მათ შეუძლიათ დაკარგონ აქტივობა.

ექსპერიმენტის მიზანი იყო იმის გადამოწმება, ნარევების შენახვა არასასურველ და ექსტრემალურ პირობებში შეიძლება გავლენა იქონიოს PCR პროდუქტის ხარისხზე. კვლევის მეორე ფაზაში უნდა მიეთითებინა, შეიძლება თუ არა არააქტიური PCR რეაქტივებმა, რომლებმაც დაკარგეს აქტივობა, აღადგინონ მათი ფერმენტული თვისებები.

მასალა და მეთოდები

ხუთი განსხვავებული კომერციულად ხელმისაწვდომი სამაგისტრო ნარევი არახელსაყრელ პირობებში იქნა ინკუბირებული. PCR– ის შემდეგ ჩატარდა ელექტროფორეზი და მიღებული პროდუქტი იყო მტკიცებულება სწორი PCR რეაქციის.

შედეგები და დისკუსია

ნარევების სრული დეგრადაცია გამოიწვია მათმა ინკუბაციამ ოთახის ტემპერატურაზე 28 დღის განმავლობაში და ინკუბაციამ 100 ° C ტემპერატურაზე 60 წუთის განმავლობაში. პოლიმერაზების დამატება დეგრადირებულ ნარევებზე (ოთახის ტემპერატურაზე ინკუბაცია 28 დღის განმავლობაში) გამოიწვია ხუთივე ნარევის რეგენერაცია. 100 ° C ტემპერატურაზე 60 წუთის განმავლობაში ინკუბირებული პოლიმერაზების შემთხვევაში, რეგენერაცია ეფექტური იყო მხოლოდ ხუთი ნარევიდან ორში.

დასკვნები

ჩვენი კვლევა ადასტურებს, რომ PCR სამაგისტრო ნაზავი ხასიათდება მაღალი გამძლეობით სხვადასხვა პირობებში, ასევე ზოგიერთ შემთხვევაში შეიძლება გამოსწორდეს დეგრადაციის შემდეგ.


დნმ პოლიმერაზის თერმოსტაბილურობა

დნმ არის დინამიური მოლეკულა სტრუქტურით, რომელიც სტაბილიზირებულია დიდი რაოდენობით სუსტი ურთიერთქმედებით. დნმ-ის ორმაგი სპირალის სტაბილურობა დამოკიდებულია სხვადასხვა ფაქტორზე, მათ შორის დნმ-ის თანმიმდევრობაზე, pH- ზე, იონურ სიძლიერეზე, გამხსნელებზე და ტემპერატურაზე. კერძოდ, ტემპერატურის მატებასთან ერთად, სუსტი ურთიერთქმედებები თანმიმდევრულად ირღვევა, რაც პირველ რიგში იწვევს ტერმინალის და შერჩეული შიდა მიმდევრობის ლოკალიზებულ დენატურაციას და საბოლოოდ იწვევს დნმ -ის ძაფების სრულ გამოყოფას. რამდენად ამ დესტაბილიზაციის სასურველი ან შემწყნარებელი დამოკიდებულია განაცხადზე.

მაგალითად, კლონირების პროცედურები, როგორიცაა საბოლოო გაპრიალება, მაქსიმალურია ტერმინების სტაბილიზაციისას, რაც მეზოფილური ორგანიზმიდან მიღებული პოლიმერაზის გამოყენებას გვთავაზობს. მეორე ნაწილის cDNA სინთეზი და მეტსახელის თარგმანი არის სხვა პროგრამები, რომლებიც ტრადიციულად იყენებენ მეზოფილურ ფერმენტებს. ასეთი ფერმენტები მაქსიმალურად აქტიურია 25 & ndash40 & degC ტემპერატურაზე და ინარჩუნებენ მნიშვნელოვან აქტივობას დაბალ ტემპერატურაზეც. საერთოდ, ისინი შეიძლება იყოს სითბოს ინაქტივირებული და იმუშაონ იმავე ბუფერებში, რომლებიც გამოიყენება შეზღუდვის ენდონუკლეაზებისა და ლიგაზების მიერ, რაც აცილებს დნმ-ის შუალედური გამწმენდის საჭიროებას.

სხვა მრავალი მოლეკულური ბიოლოგიის პროგრამა, როგორიცაა PCR, მოითხოვს მაღალ ტემპერატურას დნმ -ის შესაცვლელად გრუნტის შეხებამდე ან პოლიმერიზაციის დროს მეორადი სტრუქტურის შესამცირებლად, რითაც მცირდება პოლიმერაზას პაუზა. არქეალური დნმ პოლიმერაზები, როგორიცაა Vent & reg (NEB #M0254) და 9 & degN& ვაჭრობა (NEB #M0260) მომდინარეობს ჰიპერთერმოფილებისგან და უკიდურესად გამძლეა სითბოს ინაქტივაციის მიმართ, თუნდაც 100 გრადუს ტემპერატურაზე და აჩვენებს მაქსიმალურ პოლიმერაზულ აქტივობას 75 & ndash85 & degC. ბაქტერიულმა თერმოფილებმა გამოიღეს ისეთი ფერმენტები, როგორიცაა თაკ დნმ პოლიმერაზა, რომელიც აქტიურია მსგავს ტემპერატურაზე, მაგრამ არ არის ისეთი სტაბილური 95 ° C- ზე, როგორც მისი ზოგიერთი არქეოლოგიური კოლეგა.

Vent & reg არის რეგისტრირებული სასაქონლო ნიშანი New England Biolabs, Inc.
9 & დეგ& სავაჭრო არის New England Biolabs– ის სავაჭრო ნიშანი, inc.


თაკ ფაქტები

როდესაც პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) პირველად იქნა აღწერილი, კლენოუს ფრაგმენტი, რომელიც წარმოიშვა Escherichia coli დნმ პოლიმერაზა I– დან იყო უმთავრესი ფერმენტი მიმდევრობის გაფართოებისთვის. მაღალი ტემპერატურის დროს სტაბილურობის არარსებობის გამო, საჭიროა მისი შევსება ყოველი ციკლის წინ. თერმოფილური ბაქტერიების აღმოჩენისთანავე, რომლებიც ხარობენ 45 ° C- ზე მეტ ტემპერატურაზე, გამოიკვლიეს სითბოს მდგრადი პოლიმერაზები, რომლებიც მოქმედებენ უფრო მაღალ ტემპერატურაზე, რათა გამოირიცხოს ფერმენტის შევსების საჭიროება ყოველი დენატურაციის ციკლის შემდეგ.

თაკ დნმ პოლიმერაზა თავდაპირველად იზოლირებული იყო დეინოკოკუს-თერმუსის ჯგუფის თერმოფილური ბაქტერიისგან, რომელიც მდებარეობს იელოუსტოუნის ეროვნული პარკის ქვედა გეიზერის აუზთან, თომას დ. ბროკმა და ჰადსონ ფრიზმა, 1969 წელს. ამ აყვავებულ ბაქტერიას დაარქვეს სახელი. წყლის თერმუსი (T. aquaticus). T. aquaticus– დან გამოყოფილია რამდენიმე ფერმენტი, რომელთაგან ყველაზე ცნობილია თაკ დნმ პოლიმერაზა (თაკ). თაკ შეიძლება იზოლირებული იყოს როგორც მისი საწყისი წყაროდან, ასევე მისი კლონირებული გენიდან გამოხატული E. coli. თანმიმდევრობასა და სტრუქტურაში ბევრი მსგავსება არსებობს E. coli დნმ პოლიმერაზას I და თაკ, განსხვავებები ფერმენტის ფუნქციონირებაში, ხასიათსა და დამოკიდებულებებში თაკ იდეალური პოლიმერაზა qPCR- ზე დაფუძნებული გენების გამოხატვის ანალიზისათვის, გარკვეული ბაქტერიული გენების მგრძნობიარე ღონისძიებების გამოკლებით. ეს გაფრთხილება მოგვიანებით განმარტებულია.

დახასიათება წყლის თერმუსი დნმ პოლიმერაზა

ფუნქციონალურობა: 5 -დან 3 -მდე ეგზონუკლეაზის აქტივობის გამოყენება თაკმკვლევარებს შეუძლიათ ერთდროულად მიაღწიონ PCR გაძლიერებას და სიგნალის გათავისუფლებას სამიზნე სპეციფიკური ფლუოროგენული ზონდიდან. 5 -დან 3 -მდე ეგზონუკლეაზის აქტივობა თაკ ანგრევს ჰიბრიდიზებული ოლიგო ზონდის 5 'ტერმინს, რათა გამოთავისუფლდეს როგორც მონო- ასევე ოლიგონუკლეოტიდები. ზონდი ჰიდროლიზდება ძაფის რეპლიკაციასთან ერთად ისე, რომ დაგროვილი ფლუორესცენტური სიგნალი კორელაციაშია გაძლიერებასთან.

ზომა და აქტივობა: მიუხედავად იმისა, რომ ცვლადი წონაა მოხსენებული, სავარაუდო ზომა თაკ არის 94 კდ, დნმ-პოლიმერაზის აქტიურობით ლოკალიზებულია C- ტერმინალში და 5-დან 3 '-მდე ეგზონუკლეაზის აქტივობა ლოკალიზებულია N- ტერმინალში. დღემდე, არ არის დაფიქსირებული 3-დან 5-მდე ეგზონუკლეაზის აქტივობა, როგორც სხვა პოლიმერაზებში, სადაც 3'-ბოლოანი შეუსაბამო ფუძე ამოღებულია "კორექციის" პროცესის დროს. შეცდომის მაჩვენებელი უკვე დაბალია 10 -5 -მდე ბაზის შეცვლის შეცდომებისთვის და 10 -6 ჩარჩო -ცვლის შეცდომებისთვის.

ტემპერატურაზე დამოკიდებულება: თერმოფილები გავრცელებულია ბუნებაში და ზოგიერთი პროკარიოტული სახეობა ხარობს 45 ° C- ზე ზემოთ ტემპერატურაზე. თაკ ოპტიმალურ მნიშვნელობას ანიჭებს 80 ° C ტემპერატურაზე, სადაც მისი კატალიზური აქტივობა ათჯერ აღემატება 37 ° C ტემპერატურას. შესაძლებელია, რომ 80 ° C- ზე ზემოთ აქტივობის დაქვეითება რეალურად განპირობებული იყოს ორჯაჭვიანი დნმ-ის დენატურაციით. ტემპერატურა.

ერთვალენტიანი და ორვალენტიანი კათიონური დამოკიდებულებები: ოპტიმალური მუშაობისთვის საჭირო მარილის კონცენტრაცია ითვლება 40 მმ NaCl და 60 მმ KCl. ამ ერთვალენტიანი კატიონებისთვის 100 მმ -ზე მეტი კონცენტრაცია ამკრძალავს კატალიზურ მოქმედებას. ეს ეწინააღმდეგება E. coli პოლიმერაზა I ფერმენტის მარილისადმი მგრძნობელობას. გარდა ამისა, თაკ შეიძლება დამოკიდებული იყოს - სხვა პოლიმერაზების მსგავსად - ორვალენტიანი კატიონების არსებობაზე, კერძოდ MgCl2 ან MnCl2, ოპტიმალური კონცენტრაციით, დამოკიდებულია ექსპერიმენტულ დიზაინზე. მანგანუმის უფრო მაღალმა კონცენტრაციამ შეიძლება გამოიწვიოს ნუკლეოზიდის ჩართვის შეცდომის მაჩვენებელი. სხვა დივალენტურ იონებთან აქტივობა შეიძლება მნიშვნელოვნად შემცირდეს ან არ არსებობდეს, როგორც ეს ხდება 0.25 მმ -ზე მეტ Ca +2– ზე. თაკ მოითხოვს დეოქსირიბონუკლეოზიდ ტრიფოსფატების და დნმ -ის ოთხივე სახეობის არსებობას ოპტიმალური კატალიზური აქტივობისათვის.

pH დამოკიდებულება: ფერმენტის pH ოპტიმალურია 7-8 pH ერთეულის ფარგლებში 80 ° C ტემპერატურაზე და იცვლება გამოყენებული ბუფერული სისტემის მიხედვით. მაგალითად, 25 მმ ტრის-ჰიდროქლორიდის ბუფერში, ტუტე ოპტიმალურია pH 7.8 ერთეული.

დიდი გაფრთხილება: დაუპატიჟებელი სტუმრები

ზოგჯერ კლონირებული თაკ პოლიმერაზას აქვს ბაქტერიული დნმ -ის დამაბინძურებელი, რომელიც შესაძლოა გადავიდეს გამოხატვის ვექტორული სისტემიდან ან პოლიმერაზას წარმოების დროს გამოყენებული სხვა წყაროებიდან. ამ ნარჩენმა დაბინძურებამ შეიძლება შეზღუდოს კლონირებული გამოყენება თაკ განსაზღვრულ ნიმუშებში განზავებული ბაქტერიული დნმ -ის გამოვლენისას. კვალი დაბინძურების აღმოფხვრა შეუძლებელია და მართლაც, კომერციულად ხელმისაწვდომი Taq– ის დაბინძურების რაოდენობის შეფასების თანახმად, ფერმენტის ერთეულზე ბაქტერიული დნმ -ის 1000 გენომის ეკვივალენტია.

ბაქტერიული დნმ -ის ამოღების რამდენიმე მეთოდი თაკ პოლიმერაზა შემოწმებულია და გამოჩნდა ლიტერატურაში. ისეთი მეთოდები, როგორიცაა ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედება 320 ნმ ქვემოთ (UVB ან UVC), ახდენს დნმ -ის გამძლეობას გამაძლიერებლად, თუმცა ის ასევე აისახება მთლიანობაში. თაკ პოლიმერაზა, ამცირებს ნუკლეოზიდის ჩართვის ეფექტურობას. ულტრაფილტრაცია თაკ პოლიმერაზა, მიუხედავად იმისა, რომ ხშირად შეუძლია აღმოფხვრას ცრუ დადებითი, მაგრამ ამას აკეთებს ანალიზის მგრძნობელობის შემცირების არასასურველი ეფექტით. ულტრაიისფერი სხივებით გააქტიურებული 8-მეთოქსიპსორალენური მკურნალობა, რათა დაინფიცირდეს დნმ ორჯაჭვიან დნმ-ში, რთულია ოპტიმიზაცია და აფერხებს PCR რეაქციას. ზემოაღნიშნული მეთოდების გარდა, შეზღუდულია ენდონუკლეაზები და დნმ -ი I მკურნალობა დნმ -ის შესანარჩუნებლად თაკ პრეპარატებმა შეიძლება შემოიტანონ დამაბინძურებლები ან თავად გახდნენ დამაბინძურებლები.

უახლესი მეთოდოლოგია დაკითხვისას არის სერიული განზავება თაკ პოლიმერაზა (32-ჯერ) ეფექტურად განზავდეს დაბინძურებული ბაქტერიული დნმ შენარჩუნებისას თაკ აქტიურობა და მგრძნობელობა. ეს ტექნიკა იწვევს რეაქციის პლატოზე დაბალ ციკლის რიცხვს. ეს ეფექტი წარმოშობს ქვედა სიგნალს საბოლოო წერტილის ანალიზში, მინიმალური შედეგი რაოდენობრივ მაჩვენებელს ემყარება ექსპონენციალური ფაზის ზღურბლზე დაყრდნობით.


ფერმენტი: Taq სტაბილურობა - (21 ნოემბერი/2011 წ.)

მე მაინტერესებს "მკაცრი სიფრთხილე" ფერმენტების შენახვის შესახებ -20 °C ტემპერატურაზე. მწარმოებლები ხშირად ამბობენ, რომ ჩვენ უნდა შევინარჩუნოთ ფერმენტები (მაგ. Taq) მიღებისას -20 °C ტემპერატურაზე. თუმცა, ეს ფერმენტი გამოიყენება PCR– ში 95 °C ტემპერატურაზე მინიმუმ 2 საათის განმავლობაში და რჩება აქტიური 95/55 და#176C ! ალტერნატიული ციკლების შემდეგ, რაც ნიშნავს რომ მისი სტაბილურობა ძალიან მაღალია.
ასევე, თუ შევხედავთ ჭურჭლის სარეცხი მანქანის თხევად, ყველა ფერმენტი ინახება ოთახის ტემპერატურაზე და რჩება აქტიური#33
ასე რომ, ჩემი შეკითხვა, არის თუ არა ჩემი უფროსი პანიკის უფლება, როდესაც მე მავიწყდება Taq სკამზე რამდენიმე წუთის განმავლობაში?

Taq და მრავალი სხვა ფერმენტი დეგრადირდება საკმაოდ სწრაფად ოთახის ტემპერატურაზე, რამდენიმე წუთი ალბათ კარგია, მაგრამ რა თქმა უნდა საათები არა. 95 გრადუს ტაკზე საკმაოდ სწრაფად იშლება, მე ვფიქრობ, რომ ის სტაბილურია მხოლოდ რამდენიმე წუთის განმავლობაში. ჭურჭლის სარეცხ მანქანაში და სხვა ფერმენტები სტაბილიზირებულია ან არის ფორმები, რომლებიც მდგრადია დეგრადაციის მიმართ. თუ გსურთ შეისწავლოთ სტაბილური ფერმენტები - RNase კარგი ადგილია დასაწყებად.

ისე, რომ არ დატოვოთ ოთახის ტემპერატურაზე, კარგი პრაქტიკაა ის ყოველთვის ყინულზე.

Მადლობა პასუხისთვის.
თქვენ ამბობთ, რომ Taq სტაბილურია რამდენიმე წუთის განმავლობაში, როგორ ხდება ეს PCR გაშვებაში, რომელიც გრძელდება

1h30? თუ ის სტაბილურია მხოლოდ რამდენიმე წუთის განმავლობაში, ეს ნიშნავს, რომ დნმ არ იქნება ეფექტურად გაძლიერებული !
PCR მუშაობის დროს, Taq აქტიურია დნმ -ის გასაძლიერებლად, თუ ის დეგრადირებულია, არ იქნება დნმ გაძლიერებული, ან მხოლოდ ძალიან მცირე რაოდენობით !

Invitrogen– ს ტაკს აქვს ნახევარგამოყოფის პერიოდი:

5 წუთი 97.5 და#176C ტემპერატურაზე
40 წუთი 95 და#176C ტემპერატურაზე
120 წუთი 92.5 °C ტემპერატურაზე

ვფიქრობ, სხვა კომპანიების ტაკებს აქვთ მსგავსი ღირებულებები. ამიტომ მაღალი ტემპერატურა არ წარმოადგენს ამ პრობლემას მოკლე დროში. ყოველ შემთხვევაში ეს არის წუთები და მე არასოდეს შევინახავ მას მაღალ ტემპერატურაზე ან მაცივარში, რადგან დრო არის დღეები, კვირები ან თვეები. -20 გრადუსი თქვენ თავიდან აიცილებთ ნელ, თანდათანობით დეგრადაციას, მაგრამ ინარჩუნებთ აქტიური ფერმენტის მეტ -ნაკლებად მუდმივ კონცენტრაციას.

თაკ პოლიმერაზა საკმაოდ სტაბილურია ოთახის ტემპერატურაზე ექვსი თვის განმავლობაში იმ პირობით, რომ ის არ არის გახსნილი და#33 თუ იგი არაერთხელ გაიხსნება, თქვენ გექნებათ კარგი შანსი კულტივირება მოახდინოთ სასიამოვნო ჰაერის ბაქტერიული ან სოკოვანი დაბინძურების 50% გლიცეროლის შესანახ ბუფერში.
(დუნკან კლარკი, შპს DNAmp (ლიცენზირებული PCR ფერმენტის მწარმოებელი) 03.08.96 საათზე http://www.bio.net/bionet/mm/methods/1994-. ber/019005.html)

სკამზე ღამით დამავიწყდა ტაკი.
მაინც მუშაობდა.

უმჯობესია შეინახოთ -20 °C ტემპერატურაზე, მაგრამ თუ ერთხელ დაგავიწყდათ, არ გჭირდებათ მისი ნაგვის გატანა. სცადეთ ერთი ან ორი ნიმუში, რომ ნახოთ მუშაობს თუ არა.
მე რომ შენი უფროსი ვიყო, პანიკაში არ ჩავვარდებოდი, მაგრამ მაინც ვყვიროდი, რომ არ დაგავიწყდეს ფერმენტი სკამზე.


რა მოთხოვნები აქვს დნმ პოლიმერაზას, რომელიც გამოიყენება PCR– ში?

PCR– ში გამოყენებული დნმ პოლიმერაზის ძირითადი მოთხოვნებია ოპტიმალური აქტივობა 75*C ტემპერატურაზე და უნარი შეინარჩუნოს ეს აქტივობა გახანგრძლივებული ინკუბაციის შემდეგ კიდევ უფრო მაღალ ტემპერატურაზე.

ახსნა:

PCR მოითხოვს დნმ პოლიმერაზას ფერმენტს, რომელიც ქმნის დნმ -ის ახალ ძაფებს, შაბლონების სახით იყენებს არსებულ ძაფებს.

დნმ პოლიმერაზა, რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება PCR– ში, ეწოდება Taq პოლიმერაზა და იზოლირებულია სითბოს მდგრადი ბაქტერიიდან Thermis aquaticus. T. წყლის ბინადრობს ცხელ წყაროებში და ჰიდროთერმულ ხვრელებში. მისი დნმ პოლიმერაზა ძალიან მდგრადია სითბოს მიმართ და ყველაზე აქტიურია 70*C ტემპერატურაზე. ეს სითბოს სტაბილურობა Taq პოლიმერაზას იდეალურ ხდის PCR– სთვის, რადგან მაღალი ტემპერატურა არაერთხელ გამოიყენება PCR– ში შაბლონის დნმ -ის გასადიდებლად, ან მისი ძაფების გამოყოფისთვის.
Pfu დნმ პოლიმერაზა Pyrococcus furiosus– დან ასევე გამოიყენება მისი უფრო მაღალი ერთგულების გამო დნმ – ის კოპირებისას.


პფუ პოლიმერაზები

ერთ -ერთი მთავარი პოლიმერაზა, რომელსაც ადამიანები მიმართავენ მაშინ, როდესაც მათ სჭირდებათ მაღალი ერთგულება პფუ (Pyrococcus furiosus) დნმ პოლიმერაზა. ეს პოლიმერაზები იზოლირებულია Pyrococcus furiosus, არქეას ექსტრემოფილური სახეობა, რომელიც ხარობს უკიდურესად მაღალ ტემპერატურაზე. ეს პოლიმერაზა იდეალურია პროდუქტების ინდივიდუალურად კლონირებისათვის თანმიმდევრობით, მუტაგენეზით ან ექსპრესიული ექსპერიმენტებით. განსხვავებით თაკ დნმ პოლიმერაზა, პფუ დნმ პოლიმერაზას გააჩნია 3 ′ დან 5 ′ ეგზონუკლეაზის კორექციის აქტივობა, რაც იმას ნიშნავს, რომ ის დნმ-ის გასწვრივ მიდის 5 ′ ბოლოდან 3 ′ ბოლომდე და ასწორებს ნუკლეოტიდ-არასწორი ჩართვის შეცდომებს. Ეს ნიშნავს რომ პფუ დნმ პოლიმერაზას წარმოქმნილ PCR ფრაგმენტებს ექნება ნაკლები შეცდომები, ვიდრე თაკ-გენერირებული PCR ჩანართები, გამოქვეყნებული შეცდომის მაჩვენებელი დაახლოებით 1.3 × 10? 6 შეცდომებით თითო ფუძე წყვილზე თითო დუბლირება. Pfu– ს მინუსი არის მისი სიჩქარე, რომელიც უფრო ნელია ვიდრე ის თაკრა აერთიანებს პფუ და თაკ გაძლევთ საუკეთესო ვარიანტს სიჩქარის მიღებისას თაკ -ის ერთგულებით პფუ.

დაძლევის dUTP მოწამვლა პფუ

პფუ ასევე განიცდის dUTP მოწამვლას და გამოსწორებულია ვარიანტით სახელწოდებით პფუ ტურბო (პფუ და ArchaeMaxx ფაქტორების კომბინაცია). dUTP მოწამვლა გამოწვეულია dUTP დაგროვებით dCTP დეამინირებით და იწვევს თქვენი ფერმენტის მიერ კორექციის შემცირებას. ArchaeMaxx არის dUTPase, რომელიც შხამიანი dUTP- ს გარდაქმნის უვნებელ dump- ზე (საკმაოდ მშვენიერი სახელი!) +IPP

ინჟინერირებული ფერმენტები

ერთგულების კიდევ უფრო გაზრდისა და გახანგრძლივების სიჩქარის გასაუმჯობესებლად შეიქმნა პოლიმერაზების ახალი ფორმები. ამ დიზაინერული ფერმენტების უმეტესობა ემყარება ან შეცვლილ ფორმებს პფუ დნმ პოლიმერაზა. მოდიფიკაციებმა საშუალება მისცა გაზარდოს ფერმენტის სიჩქარე და მტკიცებულების წაკითხვის უნარი, ასე რომ, თუ თქვენ გჭირდებათ სწრაფი, ძალიან მაღალი ერთგულების ფერმენტები, ეს არის ის, რასაც თქვენ ეძებდით. ამის მაგალითებია NEB– ის Phusion პოლიმერაზა, Gene-On– ის ერთჯერადი დნმ პოლიმერაზა და Agilent– ის პფუUltra II Fusion HS დნმ პოლიმერაზა.


-ის სტაბილიზაცია თაკ დნმ პოლიმერაზა მაღალ ტემპერატურაზე ცილის დასაკეცი ბილიკებით ჰიპერთერმოფილური არქეონიდან, Pyrococcus furiosus

Pyrococcus furiosus, ჰიპერთერმოფილური არქეონი ოპტიმალურად იზრდება 100 ° C- ზე, აკოდირებს სამ ცილოვან ჩაპერონს, მცირე სითბოს შოკის ცილას (sHsp), პრეფოლდინს (Pfd) და ჩაპერონინს (Cpn). ამ კვლევაში ჩვენ ვაცხადებთ, რომ პასიური მიმდევრები sHsp და Pfd from P. furiosus შეუძლია გააძლიეროს ATP- ზე დამოკიდებული Cpn- ის ცილების გადახვევის აქტივობა იმავე ჰიპერთერმოფილისგან. თერმო-სტაბილურობა თაკ პოლიმერაზა მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა კომბინაციით P. furiosus ჩაპერონები, რომლებიც აჩვენებენ ცილების დასაკეცი აქტივობას მომატებულ ტემპერატურაზე და თერმული ციკლის დროს. ამ შედეგების საფუძველზე, ჩვენ ვთავაზობ, რომ ცილის დასაკეცი აპარატი ჰიპერთერმოფილურ არქეონში, P. furiosus შეიძლება გამოყენებულ იქნას მაღალი ტემპერატურის ბიოკატალიზატორების გამძლეობისა და ხარჯების ეფექტურობის გასაზრდელად. © 2005 Wiley Periodicals, Inc.


ტაკ პოლიმერაზის სტაბილურობა მაღალ ტემპერატურაზე - ბიოლოგია

MB016-HYT: მაღალი სარგებელი Taq დნმ პოლიმერაზა

* ძლიერი პროცესუალობა. 10 კბ -მდე ადამიანის გენომური და 15 კბ კმ ლამდას დნმ -ის ფრაგმენტები შემოწმებულია გაძლიერებაზე.
* მაღალი სიწმინდე. & gt98% ჰომოგენური Taq დნმ პოლიმერაზა SDS გელის ელექტროფორეზით. სტანდარტული PCR ტესტის რეაქციებში არ არის გამოვლენილი დაბინძურება.
* გამეორებადი შედეგები. მაღალი მოსავლიანობის Taq დნმ პოლიმერაზის 3 თვის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე შენახვის შემდეგ ხილული აქტივობა არ შეიცვლება ადამიანის გენომიდან ერთი ეგზემპლარი გენის გასაძლიერებლად მაღალი ეფექტურობით.
* კორექტურა 5 და ექსონუკლეაზის ძირითადი აქტივობით.

MB038-OS25: ერთსაფეხურიანი RT-PCR ნაკრები

ერთსაფეხურიანი RT-PCR ნაკრები ამარტივებს პირველადი cDNA სინთეზისა და PCR რეაქციის შეკრებას ერთ მილში და გთავაზობთ დროის დაზოგვის, მოხერხებულობის, თანმიმდევრულობის და დაბინძურების და პიპეტირების შეცდომების მინიმალურ რისკს.

MB038-TS25: ორეტაპიანი RT-PCR ნაკრები

ორეტაპიანი RT-PCR ნაკრები შეიცავს ყველა კომპონენტს, რომელიც საჭიროა პირველი რიგის cDNA სინთეზის შესასრულებლად, რასაც მოჰყვება cDNA პროდუქტის გაძლიერება ორსაფეხურიანი პროცესის გამოყენებით.

MB040-HY2: 2x HY PCR სამაგისტრო ნაზავი, ლურჯი საღებავით

* PCR სამაგისტრო ნაზავი ამარტივებს PCR რეაქციის შეკრებას და გთავაზობთ დროის დაზოგვის უპირატესობას, მოხერხებულობას, თანმიმდევრულობას და დაბინძურების და პიპეტირების შეცდომების მინიმალურ რისკს.
* მაღალი სარგებელი PCR სამაგისტრო მიქსმა გაზარდა გაძლიერების სიძლიერე, ერთგულება, სარგებელი და ფრაგმენტის სიგრძე, ასევე რთული ან & ldquodirty & rdquo შაბლონების დამუშავების უნარი.
* თვალთვალის საღებავი და ნალექი დაემატა PCR PreMix– ს ისე, რომ PCR პროდუქტი პირდაპირ დატვირთული იყოს ელექტროფორეზისთვის.

Taq ფერმენტისა და კორექციის ფერმენტის ნაზავის მახასიათებლები, რომელიც შეიცავს მაღალი სარგებელი PCR სამაგისტრო ნაზავს:
* ძლიერი პროცესუალობა. 10 კბ -მდე ადამიანის გენომური და 15 კბ კმ ლამდას დნმ -ის ფრაგმენტები შემოწმებულია გაძლიერებაზე.
* მაღალი სიწმინდე. & gt98% ერთგვაროვანი Taq დნმ პოლიმერაზა SDS გელის ელექტროფორეზის საშუალებით. სტანდარტული PCR ტესტის რეაქციებში არ არის გამოვლენილი დაბინძურება.
* გამეორებადი შედეგები. ოთახის ტემპერატურაზე Taq დნმ პოლიმერაზის 3 თვის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე შენახვის შემდეგ ხილული აქტივობა არ იცვლება ადამიანის გენომიდან ერთი ეგზემპლარი გენის გასაძლიერებლად მაღალი ეფექტურობით.
* კორექტურა 5 და ექსონუკლეაზის ძირითადი აქტივობით.

MB041-EN-1: dNTP Mix, 10 მმ თითოეული

არ შეიცავს RNase და DNase და შესაფერისია ნებისმიერი მოლეკულური ბიოლოგიისათვის, რომელიც მოითხოვს სუფთა დეოქსინუკლეოტიდებს, როგორიცაა PCR, დნმ -ის თანმიმდევრობა, cDNA სინთეზი და მეტსახელის თარგმანი.

MB067-EQ2G / MB067-EQ2B / MB067-EQ2R: 2x PCR PreMix, საღებავით (მწვანე, ლურჯი ან წითელი)

* PCR სამაგისტრო ნაზავი ამარტივებს PCR რეაქციის შეკრებას და გთავაზობთ დროის დაზოგვის უპირატესობას, მოხერხებულობას, თანმიმდევრულობას და დაბინძურების და პიპეტირების შეცდომების მინიმალურ რისკს.
* თვალთვალის საღებავი და ნალექი დაემატა PreMix– ს ისე, რომ PCR პროდუქტი პირდაპირ დატვირთული იყოს ელექტროფორეზისთვის.

PCR სამაგისტრო ნაზავში შემავალი Taq დნმ პოლიმერაზას მახასიათებლები:
* Მაღალი ეფექტურობის. Taq დნმ პოლიმერაზის გახანგრძლივების დრო 30 წამზე მოკლეა კბ დნმ -ზე. ადვილად გაამდიდრეთ დნმ -ის ფრაგმენტები 5 კბ -მდე.
* მაღალი სიწმინდე. & gt98% ერთგვაროვანი Taq დნმ პოლიმერაზა SDS გელის ელექტროფორეზის საშუალებით. სტანდარტული PCR ტესტის რეაქციებში არ არის გამოვლენილი დაბინძურება.
* გამეორებადი შედეგები. ოთახის ტემპერატურაზე Taq დნმ პოლიმერაზის 3 თვის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე შენახვის შემდეგ ხილული აქტივობა არ იცვლება ადამიანის გენომიდან ერთი ეგზემპლარი გენის გასაძლიერებლად მაღალი ეფექტურობით.
* ტერმინალური ტრანსფერაზული აქტივობა ერთი ნუკლეოტიდის (ადენოზინის) დამატებით გაფართოების პროდუქტის 3 ' ბოლოს, რაც ხელს უწყობს PCR პროდუქტების TA კლონირებას.

MB042-EUT: Taq დნმ პოლიმერაზა

* Მაღალი ეფექტურობის. Taq დნმ პოლიმერაზის გახანგრძლივების დრო 30 წამზე მოკლეა კბ დნმ -ზე. ადვილად გაამდიდრეთ დნმ -ის ფრაგმენტები 5 კბ -მდე.
* მაღალი სიწმინდე. & gt98% ერთგვაროვანი Taq დნმ პოლიმერაზა SDS გელის ელექტროფორეზის საშუალებით. სტანდარტული PCR ტესტის რეაქციებში არ არის გამოვლენილი დაბინძურება.
* გამეორებადი შედეგები. ოთახის ტემპერატურაზე Taq დნმ პოლიმერაზის 3 თვის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე შენახვის შემდეგ ხილული აქტივობა არ იცვლება ადამიანის გენომიდან ერთი ეგზემპლარი გენის გასაძლიერებლად მაღალი ეფექტურობით.
* ტერმინალური ტრანსფერაზული აქტივობა ერთი ნუკლეოტიდის (ადენოზინის) დამატებით გაფართოების პროდუქტის 3 ' ბოლოს, რაც ხელს უწყობს PCR პროდუქტების TA კლონირებას.
* დაბალი ღირებულება: 2.5+ ცენტი ერთეულზე. ყველაზე იაფი PCR ფერმენტი ბაზარზე.

MB066-EN-2: dNTP ნაკრები, თითოეული 100 მმ

არ შეიცავს RNase და DNase და შესაფერისია ნებისმიერი მოლეკულური ბიოლოგიისათვის, რომელიც მოითხოვს სუფთა დეოქსინუკლეოტიდებს, როგორიცაა PCR, დნმ -ის თანმიმდევრობა, cDNA სინთეზი და მეტსახელის თარგმანი.

MB073-PCR: 2x Long Taq PCR MasterMix (საღებავით)

რეაქციის დასაყენებლად, თქვენ მხოლოდ უნდა დაამატოთ შაბლონები, კონკრეტული პრაიმერები და წყალი.

MB103-11: უჯრედისა და ქსოვილის პირდაპირი PCR ნაკრები (დნმ-ის სწრაფი გენომური მოპოვება PCR– თან ერთად)

ხსნარებზე დაფუძნებული ერთი მილის პროტოკოლი დნმ -ის სწრაფი გენომური მოპოვებისთვის
ამოიღეთ გენომიკური დნმ ცხოველთა უჯრედებიდან და ქსოვილების ნიმუშებიდან, როგორიცაა თაგვის კუდი და კულტივირებული უჯრედები 10 წუთში
არ არსებობს ტოქსიკური ქიმიკატები, დნმ -ის ნალექი და სვეტის გამწმენდი, ან პროტეინაზას მონელება
დროის დაზოგვა, მოსახერხებელი, თანმიმდევრული და დაბინძურების და პიპეტირების შეცდომების მინიმალური რისკი
თვალთვალის საღებავი და ნალექი დაემატა PreMix– ს ისე, რომ PCR პროდუქტი პირდაპირ დატვირთული იყოს ელექტროფორეზისთვის.


რა არის დნმ პოლიმერაზა?

დნმ პოლიმერაზა არის ფერმენტი, რომელიც ახდენს ნუკლეოტიდების დნმ -ის სინთეზის კატალიზაციას. ეს არის ყველაზე ზუსტი ფერმენტი, რომელიც პასუხისმგებელია გენომის დუბლირებაზე და გენეტიკური ინფორმაციის შთამომავლობაზე გადაცემაზე. უჯრედების გაყოფისას დნმ პოლიმერაზა დუბლირებს მის მთელ დნმ -ს და გადასცემს თითო ასლს თითოეულ ქალიშვილ უჯრედში. 1955 წელს არტურ კორბერგმა აღმოაჩინა დნმ პოლიმერაზა ე კოლირა დნმ პოლიმერაზას ფუნქცია დამოკიდებულია რამოდენიმე მოთხოვნაზე შაბლონის დნმ, Mg +2 იონები, დეოქსინუკლეოტიდების ოთხივე ტიპი (dATP, dTTP, dCTP და d GTP) და რნმ -ის მოკლე მიმდევრობა (პრაიმერი). დნმ – ის სინთეზი ხდება 5– დან 3 ’მიმართულებით დნმ პოლიმერაზით.

დნმ პოლიმერაზები შეიძლება დაჯგუფდეს შვიდ სხვადასხვა ოჯახში: A, B, C, D, X, Y და RT (უკუ ტრანსკრიპტაზა). რეტროვირუსები RT– ს აკოდირებენ უჩვეულო დნმ პოლიმერაზას, რომელსაც სჭირდება დნმ – ის სინთეზისათვის რნმ შაბლონი. არსებობს ხუთი განსხვავებული ტიპის დნმ პოლიმერაზა, რომლებიც გვხვდება პროკარიოტებში, განსხვავებული როლებისთვის დნმ -ის რეპლიკაციაში. დნმ პოლიმერაზა 3 პასუხისმგებელია დნმ -ის ახალი ძაფის პოლიმერიზაციაზე. დნმ პოლიმერაზა 1 პასუხისმგებელია დნმ -ის შეკეთებასა და შელესვაზე. დნმ პოლიმერაზები 2, 4 და 5 პასუხისმგებელნი არიან დნმ -ის შეკეთებასა და შესწორებაზე. ევკარიოტებში არსებობს 15 განსხვავებული ტიპის დნმ პოლიმერაზა. მათ შორისაა ხუთი ძირითადი ოჯახი.

სურათი 2: დნმ პოლიმერაზა

დნმ პოლიმერაზები გამოიყენება გენის კლონირებაში, PCR- ში, დნმ -ის თანმიმდევრობაში, SNP გამოვლენაში, მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში და სხვა. Taq პოლიმერაზა არის დნმ პოლიმერაზის ერთ -ერთი სახეობა, რომელსაც შეუძლია გაუძლოს მაღალ ტემპერატურას და ხელმისაწვდომი იყოს დნმ -ის სინთეზისთვის დეგრადაციის გარეშე.