ინფორმაცია

ამონიუმის სულფატის ნალექების ანალიზი pH დამოკიდებულება


ზოგადად ახდენს თუ არა pH ზემოქმედება ნალექზე, მაგ. ექვს pH ექნება ნაკლები ნალექი ვიდრე pH 7.5. ან ისინი არ არიან ერთმანეთთან დაკავშირებული?


მე ვფიქრობ, რომ ის გავლენას მოახდენს ზოგიერთ ცილაზე, მაგრამ ამონიუმის სულფატის ნალექი ჩვეულებრივ მოითხოვს იმდენად დიდ რაოდენობას მარილს, რომ თქვენ უნდა დაამატოთ ბევრი ფუძე pH- ის შესაცვლელად.

როდესაც ამონიუმის სულფატის ნალექი ჩავატარე, ცილების უხეში ამოღება ხდება მთელი უჯრედიდან/მთლიანი ორგანოს ლიზატიდან - ის უფრო ჰგავს ჩაქუჩს, ვიდრე წყვილ პინცეტს რაც შეეხება ცილების გაწმენდას. მე მირჩევნია გამოვიყენო დამუხტული პლასტმასის ფისოვანი ან ზომის სვეტი, თუკი ვიზრუნებ იზოელექტრული გაწმენდაზე.


ამონიუმის სულფატი რეკომბინანტული ადენოვირუსის ნალექი კულტურის საშუალოდან: მარტივი მეთოდი ვირუსის მთლიანი მოსავლიანობის გასაზრდელად

რეკომბინანტული ადენოვირუსების (rAds) გაწმენდისა და კონცენტრაციის მეთოდების უმრავლესობაში ვირუსი, რომელიც ასოცირდება დამხმარე უჯრედებთან, იკრიბება, ხოლო უჯრედულ კულტურაში არსებული ვირუსი იშლება. ოპტიმიზირებულ პირობებში ადენოვირუს -5 ტიპის ვექტორების რუტინული გამრავლებისას ჩვენ აღვნიშნეთ, რომ საშუალოდ, ვირუსის მთლიანი რაოდენობის 47% იმყოფება კულტურის შუაგულში. ამ სხივების აღსადგენად და კონცენტრირების მიზნით, ჩვენ შევიმუშავეთ მეთოდი, რომელიც ემყარება ამონიუმის სულფატს ((NH4)2ᲘᲡᲔ4) ნალექი. 40% -ზე (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერება, არსებული ვირუსის 95 ± 6% ილექება საშუალოდან, ხოლო ცილის უმრავლესობა (85%) რჩება ხსნარში. პოლიეთილენგლიკოლთან ადენოვირუსული ნალექისგან განსხვავებით, (NH4)2ᲘᲡᲔ4ნალექების ტექნიკა საშუალებას იძლევა ნალექის გროლების შეგროვება ფილტრაციით. ჩვენ აქ ვაჩვენებთ ამას (NH4)2ᲘᲡᲔ4 უჯრედების კულტურის საშუალოდან rAds- ის ნალექი არის მარტივი და სწრაფი ტექნიკა, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ვირუსის იზოლაციის სტანდარტულ მეთოდებთან ერთად, rAds- ის მოსავლიანობის გასაზრდელად.

დაახლოებით 30 წლის წინ, ვინტერსმა და რასელმა 1 აღწერეს ადენოვირუსის გაწმენდის მეთოდი, რომელიც დღემდე ფართოდ გამოიყენება. იგი იყენებს ცეზიუმის ქლორიდის (CsCl) სიმკვრივის გრადიენტურ უჯრედთან დაკავშირებულ ადენოვირუსული ნაწილაკების ულტრაცენტრიფუგირებას. მიუხედავად იმისა, რომ მაღალი ტიტულის მქონე სუფთა ადენოვირუსების ჯგუფების მიღება შესაძლებელია, მეთოდი შრომატევადია და ძნელია მისი გაფართოება. გენური თერაპიის მოსვლასთან ერთად, აუცილებელი გახდა ფართომასშტაბიანი წარმოების და რეკომბინანტული ადენოვირუსის გაწმენდის პროცედურები. 2 ორიგინალური პროტოკოლის ცვლილებები, რამაც გამოიწვია მთლიანი მომზადების დროის შემცირება, გამოიყენებს CsCl საფეხურის გრადიენტებს ნაცვლად გამჭვირვალე- CsCl სიმკვრივისა გრადიენტები 3 ან შესწორებული CsCl გრადიენტები საქაროზის გრადიენტებისთვის .45 შემდგომ კვლევებში გამოყენებულია სვეტის ქრომატოგრაფია ზომის გამორიცხვის, ანიონის გაცვლის, ჰიდროფობიური ურთიერთქმედების ან ლითონჩელატური ფისების საფუძველზე .67 ულტრაცენტრიფუგაციის მოცულობის შეზღუდვების გათვალისწინებით მასპინძელ უჯრედებთან ასოცირებული ადენოვირუსი. თუმცა, ვირუსის მნიშვნელოვანი რაოდენობა არ ასოცირდება უჯრედებთან, მაგრამ გვხვდება კულტურის გარემოში. LUMC– ის ვირუს – ვექტორულ დაწესებულებაში ჩატარებულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ ადენოვირუსის ვექტორების მნიშვნელოვანი რაოდენობა (25–80%) არის უჯრედულ კულტურაში (ცხრილი 1), თუნდაც ოპტიმალური წარმოების პირობებში. მიუხედავად იმისა, რომ ვირუსების რაოდენობა მედიუმში მერყეობს, საშუალოდ 47% (n = 19) ვირუსი განადგურებულია, თუ იზოლირებულია მხოლოდ უჯრედთან დაკავშირებული ფრაქცია. ეს იმაზე მეტყველებს, რომ სინამდვილეში, მთლიანი შემოსავლის მომგებიანი ნაწილი ხშირად იკარგება.

ვირუსი მედიცინიდან კონცენტრირებისთვის შეიძლება დალექილი იყოს პოლიეთილენგლიკოლით 6000 (PEG-6000) .89 ამ შემთხვევაში, ვირუსის ნალექი უნდა შეგროვდეს ცენტრიფუგირებით. ამრიგად, ჩვენ ვეძებთ მეთოდს, რომელიც საშუალებას მისცემს ვირუსის ამოღებას საშუალოდან ფილტრაციით, რათა თავიდან იქნას აცილებული შედარებით დიდი მოცულობის საშუალო ცენტრიფუგირება. ამ ანგარიშში ჩვენ შევაფასეთ ამონიუმის სულფატის გამოყენება ((NH4)2ᲘᲡᲔ4ნალექი .1011 პირველ მცდელობაში, დიაპაზონი 0–100% (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერება, 10% -იანი საფეხურებით შემოწმდა Ad5CMVLuc, ლუციფერაზას გენის მატარებელი რეკომბინანტული ადენოვირუსი კულტივირების საშუალოდან. 30% -მდე გაჯერების კონცენტრაციისას ვირუსი დარჩა მედიუმში, მაგრამ 40% -ით ან უფრო მაღალი გაჯერებით ვირუსი პრაქტიკულად სრულად დაჩქარდა (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). პირობების ოპტიმიზაციის მიზნით, გაჯერების მნიშვნელობები შემოწმდა 40% -იანი წერტილის გარშემო. კულტურის საშუალო გაჯერებული იყო 30-42% -ით გაჯერების დიაპაზონში 2% -ით. ხელუხლებელი Ad5CMVLuc- ის არსებობა სხვადასხვა ფრაქციებში შეფასდა ლუციფერაზას რეპორტიორი გენის გამოხატვის დონის მეშვეობით (სურათი 1). ადენოვირუსის ნალექი დაიწყო 36% -ით (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერება და იყო სრული 40% გაჯერებით, ლუსიფერაზას ფარდობითი აქტივობით 130%. ამ გაჯერების დიაპაზონში, ლუციფერაზას აქტივობა, რომელიც მიღებული იქნა ნარჩენი ვირუსით საშუალოზე, დაეცა 11%-მდე. აღსანიშნავია, რომ აშკარა აღდგენა აღემატება მოსალოდნელ მაქსიმუმს და შეიძლება აიხსნას ვირუსის მარაგის გაწმენდით. მსგავსი დაკვირვებები დაფიქსირდა უჯრედის ლიზატებიდან ადენოვირუსის გამოყოფისას 3 და რეტროვირუსის გამოყოფის დროს მედიცინისაგან .12 ამ კვლევებში გაზრდილი აქტივობა მიეკუთვნებოდა ვირუსული ინფექციის ინჰიბიტორების მოცილებას. თუმცა, ადენოვირუსის ჯგუფები, რომლებიც დალექილია 40% -ით (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერებას ჰქონდა OD260/280 თანაფარდობა 0.6 (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). სუფთა ადენოვირუსის ჯგუფების 1.2-1.3 თანაფარდობასთან შედარებით, 7 ეს მიუთითებს ცილების მნიშვნელოვანი რაოდენობის არსებობაზე.

ლუციფერაზას აქტივობა, როგორც მაჩვენებელი ნალექის რაოდენობისათვის Ad5CMVLuc კულტურის საშუალოდან 30-42% -ზე (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერება სერია 4.4-6.4 გ (NH4)2ᲘᲡᲔ4 (შეძენილი JT Baker, Deventer, ნიდერლანდები) დაემატა 25 მლ კულტურას 30–42% გაჯერების მისაღწევად. წთ 1614 გ. მარცვალი დაიშალა 1 მლ PBS- ში, რომელიც შეიცავს 2% ცხენის შრატს. ზედიზედ და გახსნილი ნალექიანი ნიმუშების ღამის დიალიზი ჩატარდა 1 × TD- ბუფერში (25 მ M Tris, 137 მ M NaCl, 5 მ M KCl, 0.73 მ M Na2HPO4, 0.9 მ M CaCl2, 0.5 მ მგ MgCl2 pH 7.45). ეს ნიმუშები გამოიყენებოდა HepG2 უჯრედების ინფიცირებისათვის, რომლებიც ლიზირებული იყო ინფექციიდან 48 საათის შემდეგ და გაანალიზდა ლუციფერაზას აქტივობა, როგორც აღწერილია ადრე. კულტურის საშუალება. შავი ზოლები წარმოადგენს ნალექში ნაპოვნი Ad5CMVLuc ფრაქციას, ხოლო ნაცრისფერ შტრიხებს ფრაქცია ზეთოვანში.

ამ მეთოდის გამწმენდი შესაძლებლობების შესახებ მეტი ინფორმაციის მისაღებად, ჩვენ განვსაზღვრეთ ცილის რაოდენობა, რომელიც დალექილია 10% FCS შემცველი კულტურის საშუალოდან გაჯერების დიაპაზონში 0 -დან 80% -მდე (NH4)2ᲘᲡᲔ4რა როგორც ნახაზი 2 -შია ნაჩვენები, 40% გაჯერებისას შესაძლებელი გახდა არსებული ცილის 15%. არსებითად იდენტური შედეგები იქნა მიღებული საშუალო ვირუსით დაინფიცირებული უჯრედებისგან. ამგვარად, ამ პირობებში, საშუალო ცილების უმეტესობა გამოყოფილია ვირუსისგან.

ცილის ფრაქციები დალექილია კულტურის საშუალოდან სხვადასხვა (NH4)2ᲘᲡᲔ4 კონცენტრაციები. 25 მლ დულბეკოს მოდიფიცირებული არწივის საშუალების (DMEM) ნიმუშები, რომელიც შეიცავს 10%ნაყოფის ხბოს შრატს (FCS) გაჯერებულია მითითებულ პროცენტებში: 10%: 1.4 გ, 20%: 2.9 გ, 30%: 4.4 გ, 38%: 5.7 გ , 40%: 6.1 გ, 42%: 6.4 გ, 50%: 7.8 გ, 60%: 9.8 გ, 70%: 11.8 გ, 80%: 14 გ (NH4)2ᲘᲡᲔ4.11 ოთახის ტემპერატურაზე 2.5 სთ ინკუბაციის შემდეგ, ნალექი დანალექდება ცენტრიფუგირებით (15 წთ 1614 გ). მარცვალი დაიშალა PBS– ში და შემდგომში ცილის იზოლირებული რაოდენობა განისაზღვრა ბრედფორდის ცილის ანალიზის საშუალებით. ცილის საერთო რაოდენობა 25 მლ ნიმუშში ითვლება 100%.

ფართომასშტაბიანი წარმოების შემთხვევაში, რომელიც მოიცავს რამდენიმე ლიტრ ვირუსის შემცველ საშუალებას, ცენტრიფუგირების ნაბიჯი ქმნის შეზღუდვას ნორმალურ ლაბორატორიულ პარამეტრებში. ფილტრაცია შეიძლება იყოს პრაქტიკული ალტერნატივა დიდი საშუალო მოცულობის rAd ნალექის გამოყოფისთვის. ამიტომ, ჩვენ შევადარეთ (NH4)2ᲘᲡᲔ4-და PEG-6000 ნალექით გამოწვეული ადენოვირუსი ცენტრიფუგირებით ან ფილტრაციით იზოლირების შემდეგ. Ad5CMVLacZ დალექილია 40% -ით (NH4)2ᲘᲡᲔ4 გაჯერება ან 10% PEG-6000 და შედეგად მიღებული ნალექი გაწმენდილია საშუალოდან ცენტრიფუგირებით, 0,45 მკმ მემბრანის ფილტრზე გაფილტრვით, ან Whatman 3 მმ ფილტრის ქაღალდზე ფილტრაციით. როგორც ნაჩვენებია ფიგურა 3 ა -ში, არსებული ვირუსი შეიძლება პრაქტიკულად მთლიანად დაინფიცირდეს (NH4)2ᲘᲡᲔ4რა 90% -იანი აღდგენა მიიღეს, როდესაც ნალექი დანალექდება ცენტრიფუგირებით. PEG-6000 ნალექის გამოჯანმრთელება ცენტრიფუგირებით მხოლოდ ოდნავ ნაკლები იყო (84% აღდგენა). თუმცა, ფილტრაციამ გამოავლინა უფრო მკვეთრი განსხვავება ნალექის ორ მეთოდს შორის. PEG-6000 ნალექმა გაიარა ფილტრები თითქმის შეუფერხებლად: ნარჩენები მოიცავდა საწყისი მოსავლის მხოლოდ 3-4% -ს. თუმცა, (NH4)2ᲘᲡᲔ4 ნალექი შეინარჩუნა ფილტრზე მაღალი ეფექტურობით. მიუხედავად იმისა, რომ ნაშთიდან გამოსავალი უფრო ნაკლები იყო ვიდრე ცენტრიფუგირების შემდეგ მიღებული გამოსავალი, აღდგენა მაინც იყო საწყისი მასალის 46% და 61%, შესაბამისად 3MM ფილტრის და 0.45 μm ფილტრის შემთხვევაში, შესაბამისად. უფრო დაბალი გამოღება საშუალოდან ფილტრაციით ცენტრიფუგაციასთან შედარებით, არ ანაზღაურდება ფილტრატში ნარჩენი ვირუსის მომატებით. ეს მიგვითითებს იმაზე, რომ დანაკარგი არ შეიძლება მიეკუთვნებოდეს არასაკმარისი ფილტრის გათიშვას, არამედ ფილტრიდან ვირუსის არაოპტიმალურ აღდგენას.

RAd აღორძინება და მოსავლიანობა დალექილია კულტურის გარემოდან. (ა) Ad5CMVLacZ- ის აღდგენის ეფექტურობა კულტივირებული საშუალოდან (NH4)2ᲘᲡᲔ4 ან PEG-6000 და იზოლირებულია ცენტრიფუგირებით ან ფილტრაციით. 6.1 გ (NH4)2ᲘᲡᲔ4 დაიშალა 25 მლ კულტურის გარემოში. ოთახის ტემპერატურაზე 2.5 სთ ინკუბაციის შემდეგ, ნალექი დალექილი იქნა ნარევიდან 15 წთ ცენტრიფუგაციის საფეხურით 1614 გ, ან ვაკუუმური ფილტრაციით 0.45 მკმ გარსის ფილტრის გამოყენებით (Schleicher & amp Schuell, Dassel, Germany), ან 3 მმ ქაღალდის ფილტრი (Whatman International Ltd, Maidstone, დიდი ბრიტანეთი). PEG ნალექი განხორციელდა როგორც აღწერილია ადრე 9 მცირედი ცვლილებებით. მოკლედ, 25 მლ 20% (წ/ვ) PEG-6000 (BDH, Poole, UK) 2.5 მ NaCl ხსნარში შერეული იქნა 25 მლ კულტურის საშუალო საშუალებით. 4 ° C ტემპერატურაზე 3 სთ ინკუბაციის შემდეგ, ნალექი დანალექდება 15 წუთის ცენტრიფუგაციის საფეხურით 16300 გ -ზე ან ვაკუუმური ფილტრაციით 0.45 მკმ გარსის ფილტრის ან 3 მმ ფილტრის გამოყენებით. ნარჩენები ან გრანულების ნიმუშები დაიშალა 2 მლ PBS, რომელიც შეიცავს 2% HS. ყველა ნიმუში დიალიზებულია და შემდგომში მათი ტიტრები განისაზღვრება დაფის ანალიზით 911 უჯრედზე. გამოჯანმრთელების გამოსათვლელად, სარგებელი დაკავშირებული იყო ადენოვირუსის რაოდენობასთან, რომელიც იმყოფებოდა 25 მლ ორიგინალ საშუალებაში. შავი ზოლები წარმოადგენენ ვირუსულ ფრაქციას ნარჩენებში ან გრანულების ნაცრისფერი ზოლები წარმოადგენს ვირუსულ ფრაქციას, რომელიც ბინადრობს ფილტრატში ან ზემდგომში. (ბ) ვირუსული სარგებლიანობის შედარება, გამოხატული ვირუსულ ნაწილაკებში (vp), იზოლირებული უჯრედთან დაკავშირებული ფრაქციიდან ან ნალექად კულტურული საშუალებიდან. რამოდენიმე ნიმუში ნახსენები 3 ა, გაანალიზებულია HPLC– ით, ძირითადად, როგორც ეს აღწერილია შაბრამისა და სხვების მიერ. ყველა ნიმუშის ვირუსის პიკს ჰქონდა OD260/280 კოეფიციენტები 1.15 -დან 1.34 -მდე. კვანტიფიკაცია გაკეთდა ვირუს-პიკის არე 260 ნმ ინტეგრაციით Millennium 32 Software (Waters) დახმარებით. 25 მლ კულტურის საშუალოდან მიღებული სარგებელი ექსტრაპოლირებული იქნა მთლიანი წარმოების მოცულობაზე და, როგორც ასეთი, უჯრედთან დაკავშირებული ფრაქციის სარგებელთან შედარებით.

HPLC ანალიზი გამოიყენეს ზემოაღნიშნული ნიმუშების ნაწილაკების კონცენტრაციის დასადგენად და მოსავლიანობა შეადარა უჯრედის ლიზატის ვირუსის ნაწილაკების (vp) საერთო გამომუშავებას (სურათი 3 ბ). უჯრედის ლიზატის სარგებელი დაახლოებით იგივე იყო, რაც საშუალოდან მიღებული სარგებელი ფილტრაციის შემდეგ 0.45 მკმ ფილტრით, 52% წინააღმდეგ 48%. თუმცა უნდა აღინიშნოს, რომ ვირუსის მხოლოდ 61% გამოვიდა მედიუმიდან. ცენტრიფუგირების შემდეგ სარგებელი კიდევ ორჯერ აღემატებოდა უჯრედის ლიზატისგან მიღებულ სარგებელს: for (NH4)2ᲘᲡᲔ4 და PEG-6000 ნალექი, შესაბამისად, 67% წინააღმდეგ 33% და 68% წინააღმდეგ 32%. შესწავლილ იზოლაციებში vp to p.f.u. თანაფარდობა იყო 6-17 1.

დამოკიდებულია rAd ტიპისა და ზუსტი წარმოების პირობებზე, ვირუსის რაოდენობა, რომელიც იმყოფება კულტურის გარემოში, შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს. მაშინაც კი, თუ წარმოების პირობები ოპტიმიზირებულია, მცირე განსხვავებამ, მაგალითად, უჯრედის სტატუსმა ან ინოკულუმმა, შეიძლება გამოიწვიოს ცვალებადობა, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს ვირუსის შემოსავლიანი ნაწილის დაკარგვა, თუკი საშუალება გადაგდებაა (ცხრილი 1). ფართომასშტაბიანი rAd წარმოების შემთხვევაში (NH4)2ᲘᲡᲔ4 ნალექი, რასაც მოჰყვება ფილტრაცია 0,45 მკმ მემბრანის ფილტრზე, როგორც ჩანს, სწრაფი და მარტივი მეთოდია ვირუსების ამოღება საშუალოდან, განსაკუთრებით იმ შემთხვევაში, თუ მეთოდი შეიძლება კომბინირებული იყოს სტანდარტული გამწმენდი პროტოკოლებით. აქედან გამომდინარე, ჩვენ გთავაზობთ rAd მოსავლის პროტოკოლს (სურათი 4), რომელშიც ვირუსი იზოლირებულია როგორც უჯრედებიდან, ასევე კულტურის საშუალოდან. პირველ რიგში, მოსავალი იყოფა ორ ნაწილად: საშუალო და უჯრედული. კულტურის საშუალო ინკუბაციის პერიოდში (NH4)2ᲘᲡᲔ4, უჯრედები შეიძლება დაირღვეს და მომზადდეს CsCl საფეხურის გრადიენტები. ინკუბაციის დაწყებიდან სულ მცირე 2 საათის შემდეგ, ნალექი შეიძლება იზოლირდეს ფილტრაციით და დატვირთული იყოს CsCl გრადიენტზე, უჯრედის ლიზატის პარალელურად. შემდგომში, მეორე CsCl გრადიენტი და დიალიზი დაასრულებს განწმენდას. შემოთავაზებული პროცედურის მიზანშეწონილობის საილუსტრაციოდ, Ad5CMVLacZ გაიზარდა PER.C6 უჯრედებზე და გაიწმინდა შემოთავაზებული პროტოკოლის მიხედვით. გამწმენდის გასწვრივ რამდენიმე პუნქტში მიღებული სარგებელი ნაჩვენებია ცხრილში 2. როგორც ამ მონაცემებიდან შეიძლება დავასკვნათ, საშუალო ფრაქცია (A) მოიცავს უხეში ვირუსის მოსავლიანობის 30% -ს (საერთო A და C ფრაქციები). ნალექის შემდეგ, 67% -ის ამოღება შესაძლებელია საშუალოდან 33-ჯერ მოცულობის შემცირებით (B). ნალექის მითითებული პირდაპირი დატვირთვა CsCl გრადიენტზე, ამოღებული ნალექის (B) 50% გამწმენდი შედარებული იყო უხეში უჯრედის ლიზატის (C) 50% -თან. ვირუსის გამოჯანმრთელება იყო საშუალოზე (D) მინიმუმ ორჯერ მეტი (68%), ვიდრე უჯრედის ლიზატისთვის (E) (30%). შესაბამისად, საშუალო წილის წვლილი მთლიან სარგებელში გაიზარდა 40%-მდე. ცალკე გაწმენდილი ფრაქციების (D და E) კუმულატიური სარგებელი საშუალო და უჯრედის ლიზატის (F) კომბინირებული გამწმენდის მოსავლის მსგავსია. ვინაიდან კომბინირებული გაწმენდა ისეთივე ეფექტურია, როგორც ცალკეული ფრაქციების გაწმენდა, ყველაზე მოსახერხებელია უჯრედის ლიზატისა და ნალექის გაერთიანება. საერთო ჯამში, ეს მონაცემები მშვენივრად ასახავს ფიგურა 4-ში გამოსახული პროტოკოლის გამოყენებას. გახსნილი ნალექი ასევე შეიძლება გაიწმინდოს AE სვეტის ქრომატოგრაფიის საშუალებით გამწმენდი საფეხურების ჩარევის გარეშე. ეს დადასტურდა დიალიზირებული და არადიალიზირებული ნალექების HPLC ანალიზით, რომელმაც გამოავლინა ვირუსის მკაფიო მწვერვალები ყოველგვარი დარღვევის გარეშე (NH4)2ᲘᲡᲔ4 (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).

დამხმარე უჯრედებიდან რეკომბინანტული ადენოვირუსის იზოლაციის პროტოკოლი საშუალო და ფართომასშტაბიანი პროდუქციის შემთხვევაში. უჯრედთან დაკავშირებული ვირუსული ფრაქციის გაწმენდა ხდება ზემოთ აღწერილი .14 რამდენიმე ფრაქცია მითითებულია A – F სიმბოლოებით და შეესაბამება ცხრილში 2. მითითებულ ნიმუშებს.


მელანოგენური ფერმენტის ტიროზინაზას გასუფთავება და დახასიათება ღილაკის სოკოდან

მელანოგენეზი არის ბიოსინთეზური გზა ადამიანის კანის პიგმენტ მელანინის წარმოქმნისათვის. ძირითადი ფერმენტი, ტიროზინაზა, კატალიზებს მელანოგენეზის პირველი და ერთადერთი მაჩვენებლის შემზღუდველ ნაბიჯებს. მისი მელანოგენური თვისებების აღმოჩენის შემდეგ, ტიროზინაზა პირველ ადგილზე იყო და ფერმენტის მიკრობული წყაროები იძებნება. Agaricus bisporus ფართოდ ცნობილია როგორც ჩვეულებრივი საკვები სოკო, ის დიდი რაოდენობით შეიცავს ცილებს, ფერმენტებს, ნახშირწყლებს, ბოჭკოებს და დაბალი ცხიმის შემცველობას, რომლებიც ხშირად მოიხსენიება ლიტერატურაში მათი კვების ღირებულებასთან დაკავშირებით. წინამდებარე კვლევაში ტიროზინაზა საწყისი Agaricus bisporus გაწმენდილია ამონიუმის სულფატის ნალექებით, დიალიზი, რასაც მოჰყვა გელის ფილტრაციის ქრომატოგრაფია Sephadex G-100 და იონგამცვლელი ქრომატოგრაფია DEAE-Cellulose ფერმენტის გაწმენდის შედეგად, 16.36-ჯერ, 26.6% -იანი მოსავლის მისაღებად ნედლი ექსტრაქტისა და საბოლოო სპეციფიკური აქტივობა 52.19 U/მგ. SDS-PAGE ელექტროფორეზმა აჩვენა მიგრირებადი პროტეინის ზოლის მოლეკულური წონა 95 კდა. გაწმენდილი ტიროზინაზა ოპტიმიზირებულია და შედეგებმა გამოავლინა, რომ ოპტიმალური მნიშვნელობებია pH 7.0 და ტემპერატურა 35 ° C. ყველაზე მაღალი აქტივობა დაფიქსირდა მისი ბუნებრივი სუბსტრატის მიმართ, L-DOPA, რომლის აშკარა Km ღირებულებაა 0.933 მმ. ეს მიუთითებდა, რომ ტიროზინაზა გაწმენდილია Agaricus bisporus არის სამედიცინო პროგრამების პოტენციური წყარო.

1. შესავალი

ტიროზინაზა (E.C. 1.14.18.1) არის ყველგან გავრცელებული ფერმენტი, რომელიც მონაწილეობს პიგმენტაციაში. ის კატალიზებს მონოფენოლების ჰიდროქსილირებას (კრეზოლაზას აქტივობა) და დიფენოლების დაჟანგვას (კატექოლაზის მოქმედება) მოლეკულური ჟანგბადის თანდასწრებით. ფენოლების გარდაქმნა -დიფენოლები ტიროზინაზას მიერ არის პოტენციურად მიმზიდველი კატალიზატორული უნარი და ამიტომაც ტიროზინაზამ მიიქცია დიდი ყურადღება მის ბიოტექნოლოგიურ გამოყენებასთან დაკავშირებით, რადგან კატექოლის პროდუქტები სასარგებლოა როგორც წამლები ან წამლების სინთონები, მაგალითად, L-DOPA [1]. ის ასევე მნიშვნელოვან როლს ასრულებს მელანოგენის პიგმენტის წარმოქმნაში მელანოციტებში მელანოციტებში, რომლებიც განლაგებულია ეპიდერმული კვანძში და ის იმყოფება ამ უჯრედებში, რომლებიც წარმოიქმნება ემბრიონის ნერვული ქერქიდან და პასუხისმგებელია მელანინის სინთეზზე. [2] იგი პირველად ძუძუმწოვრებში გამოვლინდა მელანომის განვითარებაში მისი როლის გამო და პიგმენტაციის პრობლემებში ჩართვის გამო, როგორიცაა ალბინიზმი და ვიტილიგო [3]. ტიროზინაზების ფიზიოლოგიური როლი დაკავშირებულია მელანინის ბიოსინთეზთან და ამოღებულია სხვადასხვა წყაროდან, როგორიცაა სოკოები, ხილი და ძუძუმწოვრების მელანომის სიმსივნეები [4, 5]. სოკოებში მელანინები მონაწილეობენ სტრესის ფაქტორების დაცვის მექანიზმებში, როგორიცაა ულტრაიისფერი ან გამა გამოსხივება, თავისუფალი რადიკალები, დეჰიდრატაცია და ექსტრემალური ტემპერატურა [6, 7]. სოკოვანი სპორების სტაბილურობა ასევე სარგებლობს მელანინის დამცავი როლით [8]. გარდა ამისა, ტიროზინაზები დაკავშირებულია ჭრილობების შეხორცებასთან, მცენარეებში იმუნური რეაქციით [9, 10].ადამიანებში, ტიროზინაზა მონაწილეობს პიგმენტაციაში მელანოციტებში [11-13], როგორც მარკერი მელანომის მქონე პაციენტებში [14] და როგორც სამიზნე პროპროდუქტების გააქტიურებისათვის [15]. წინამდებარე ნაშრომში, როგორც სოკოს ტიროზინაზას ფარმაცევტული პოტენციალის შეფასების საწყისი ნაბიჯი Agaricus bisporus, ჩვენ მივიღეთ ფერმენტის წინასწარი დახასიათება. დამახასიათებელი ტიროზინაზა აჩვენა ძალიან დიდი მსგავსება ადამიანის ტიროზინაზასთან შედარებით, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ გაწმენდილი და დახასიათებული სოკო შეიძლება იყოს ტიროზინაზას აყვავებული წყარო მელანოგენეზის სამკურნალო მიზნებისთვის.

2. მასალები და მეთოდები

2.1 ტიროზინაზას მომზადება

სოკოს ტიროზინაზის მოპოვება განხორციელდა კამაჰლდინისა და სხვების მეთოდით. [16], რამდენიმე მოდიფიკაციით. დაჭრილი სოკო ჰომოგენიზებულ იქნა ბლენდერის საშუალებით. ფერმენტის მოპოვება მომზადდა 500 მლ ცივი 100 მლ ფოსფატის ბუფერული (pH 5.8) 300 გრ სოკოზე. ჰომოგენატი იყო ცენტრიფუგირებული 5000 rpm 30 წუთის განმავლობაში და შეაგროვა ზეწარი. ნალექები შერეული იყო ცივი ფოსფატის ბუფერთან და მიეცა საშუალება გაჩერებულიყო ცივ მდგომარეობაში, დროდადრო შერყევით. შემდეგ ბუფერული შემცველი ნალექი კიდევ ერთხელ დაექვემდებარა ცენტრიფუგირებას ზეწოლის შესაგროვებლად. სუპერნატანი გამოიყენებოდა როგორც ფერმენტის წყარო.

2.2. ფერმენტის გაწმენდა ნედლი ექსტრაქტისგან

ტიროზინაზას გაწმენდა ჩატარდა კამაჰლდინისა და სხვების მეთოდით. [16], მცირე მოდიფიკაციით. ნედლი ფერმენტის ექსტრაქტი გაწმენდილი მარილის ნალექებით, დიალიზი, გელი ფილტრაცია, იონგამცვლელი ქრომატოგრაფია და სხვ. ამგვარად წარმოქმნილი სუფთა ფერმენტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას შემდგომი ანალიზისთვის.

2.3. ამონიუმის სულფატი ნალექი და დიალიზი

ამონიუმის სულფატის ნალექი გაკეთდა ყინულის აბაზანაში წვრილად დასაბუთებული ამონიუმის სულფატის გამოყენებით. ფხვნილი იწონიდა და ნელ -ნელა ემატებოდა ექსტრაქტს მუდმივი მორევით სრული ხსნადობის უზრუნველსაყოფად, ხოლო ხსნარი ცენტრიფუგირდებოდა 5000 rpm– ზე 30 წუთის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე. განხორციელდა ნალექების სხვადასხვა საფეხურები ტიროზინაზას ფერმენტის ნალექებისათვის (45-80%) და ნალექები შეგროვდა. ნალექი დიალიზირებულია 100 მლ კალიუმის ფოსფატის ბუფერის წინააღმდეგ (pH 7.0) 24 საათის განმავლობაში ბუფერის სამჯერ შეცვლით. დიალიზირებული ფრაქცია გამოიყენება ტიროზინაზას აქტივობისა და ცილის შემცველობისთვის.

2.4 ტიროზინაზას აქტივობის ანალიზი

ტიროზინაზას აქტივობის ანალიზი ჩატარდა როგორც სუნისა და ჩოს [17] სპექტროფოტომეტრიულად, გაზომვა L-DOPA– ს წითელი ფერის ჟანგვის პროდუქტი დოპაქრომად. რეაქციის საწყისი სიჩქარე პროპორციულია ფერმენტის კონცენტრაციასთან. თიროზინაზას შემცველი ნაშთი ინკუბირებულია 5 წუთის განმავლობაში 35 ° C ნულოვან დროს, 1 მლ L-DOPA ხსნარი (4 მგ/მლ) 475 ნმ. დამატებით 5 წუთის განმავლობაში ინკუბაციის შემდეგ, ნარევი კვლავ შეირყა და განისაზღვრა მეორე მაჩვენებელი და იზომება 3 წუთის განმავლობაში. შთანთქმის ცვლილება იყო ფერმენტის კონცენტრაციის პროპორციული. ფერმენტის ერთი ერთეული შეესაბამება იმ რაოდენობას, რომელიც კატალიზაციას უწევს 1 -ის გარდაქმნას μმოლი სუბსტრატი პროდუქტზე წუთში ზემოაღნიშნულ პირობებში და წარმოქმნა შთანთქმის 1,35 ცვლილება. სპეციფიკური აქტივობა გამოიხატებოდა როგორც ფერმენტის ერთეული პროტეინის მილიგრამზე. ფერმენტის ცილის შემცველობა განისაზღვრა ლოურის მეთოდით [18], სტანდარტული იყო ძროხის შრატის ალბუმინი.

2.5. Sephadex G-100 ლარი ფილტრაცია

დიალიზირებული ამონიუმის სულფატის ფრაქცია გამოიყენეს Sephadex G-100 სვეტში, რომელიც წინასწარ იყო წონასწორობაში 100 მმ ფოსფატის ბუფერთან ერთად pH 7.0. ცილის გამორეცხვა განხორციელდა იმავე ბუფერით 5 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით. ფრაქციები შეგროვდა 4 ° C ტემპერატურაზე. იგი გაანალიზდა ცილისთვის 280 ნმ -ზე, ასევე ფერმენტულ აქტივობაზე. აქტიური ფრაქციები გაერთიანებულია, დიალიზდება pH 7.0 -ის 100 მმ ფოსფატის ბუფერის წინააღმდეგ და კონცენტრირდება.

2.6 DEAE- ცელულოზის სვეტის ქრომატოგრაფია

ამონიუმის სულფატის ნალექის და Sephadex G-100 სვეტის შემდეგ მიღებული დიალიზირებული ფერმენტის მომზადება დაექვემდებარა იონგამცვლელ ქრომატოგრაფიას DEAE- ცელულოზის სვეტის გამოყენებით (20 × 1 სმ). დიალიზირებული ფერმენტის პრეპარატი დატვირთული იყო DEAE- ცელულოზის სვეტზე, რომელიც წინასწარ იყო წონასწორობაში კალიუმის ფოსფატის ბუფერთან (100 მმ, pH 7.0). სვეტი ჯერ გარეცხილია დაბალანსებული ბუფერით და შემდგომ შეკრული ცილები ამოიღეს წრფივი გრადიენტის 0-100 მმ NaCl და 0-100 მმ კალიუმის ფოსფატის ბუფერის გამოყენებით 1 მლ წუთში. ფრაქციები (თითოეული 2.5 მლ) შეაგროვეს და გაანალიზეს ტიროზინაზას აქტივობისთვის, ხოლო მაღალი აქტივობის მაჩვენებლები გაერთიანდა და გამოიყენეს SDS-PAGE ანალიზისთვის.

2.7. ნატრიუმის დოდეცილ სულფატი-პოლიაქრილამიდის გელი (SDS-PAGE) გაწმენდილი ტიროზინაზას ელექტროფორეზი

SDS-PAGE შესრულდა 12% გამყოფი გელის და 4% დაწყობის გელის გამოყენებით. ნიმუშები გაცხელდა 5 წუთის განმავლობაში 100 ° C ტემპერატურაზე დახურულ ფლაკონებში 1% (w/v) SDS თანდასწრებით β-მერკაპტოეთანოლი. ელექტროფორეზი ჩატარდა 125 V ტემპერატურაზე 4 სთ-ით ტრის-HCl ბუფერში pH 8.3. ელექტროფორეზის შემდეგ, გამყოფი გელის ცილები ხილული გახდა Coomassie Brilliant Blue R-250 შეღებვით. სტანდარტები, რომლებიც გამოიყენება მოლეკულური წონის ნაკვეთის გადასაადგილებლად ცილის ზოლის მიმართ, იყო ლიზოზიმა (20 კდ დ), მიოგლობინი (26 კდ დ), ნახშირბადის ანჰიდრაზა (38 კდ დ), ოვალბუმინი (46 კდ დ), გლუტამატი (62 კდ დ), ძროხა შრატის ალბუმინი (91 kDa), β-გალაქტოზიდაზა (120 kDa) და მიოსინი (200 kDa).

2.8. PH- ის და ტემპერატურის გავლენა ფერმენტების აქტივობაზე

ტიროზინაზას აქტივობა შეფასებულია pH– ის სხვადასხვა მნიშვნელობებში, pH 3 – დან 10 – მდე დიაპაზონში, ანალიზის პირობებში და დოპაქრომის რაოდენობა განისაზღვრება. გამოყენებული ბუფერები იყო ციტრატის ფოსფატი (pH 3.0-5.0), კალიუმის ფოსფატი (pH 6.0-7.0), Tris-HCl (pH 8.0-9.0) და გლიცინი-NaOH (pH 9.0-10). ფერმენტის აქტივობის ოპტიმალური ტემპერატურა განისაზღვრა სტანდარტული რეაქციის ნარევის ინკუბაციით 35 -დან 65 ° C ტემპერატურამდე.

2.9. კინეტიკური ანალიზი

ფერმენტის კინეტიკა, რომელიც იზომება მაიკლელის მუდმივობით (კმ) განისაზღვრება, როგორც სუბსტრატის კონცენტრაცია მაქსიმალური სიჩქარის ნახევარში, ფერმენტული რეაქციების სიჩქარე, რეაქციის სიჩქარის დაკავშირებით სუბსტრატის კონცენტრაციასთან. მიხაილისის მუდმივი (კმ) გაწმენდილი ფერმენტის მნიშვნელობა შეფასებულია ტიროზინაზას სპექტრში. გაწმენდილი ტიროზინაზას აშკარა Km მნიშვნელობა გამოითვლება Lineweaver-Burk ნაკვეთებიდან, რომელიც ეხება 1/V 1/[S]-ს.

3. შედეგები და დისკუსია

3.1. ტიროზინაზას ნაწილობრივი გამწმენდი

სოკო შეიცავს უამრავ სხვადასხვა ფენოლურ ნაერთს, რომლებიც ადვილად იჟანგება ჰომოგენიზაციის პროცესში. სოკოს ექსტრაქტის ფენოლის შემცველობის დაჟანგვისა და თანმიმდევრული პოლიმერიზაციისას წარმოიქმნება მელანინების მაკრომოლეკულები. სოკოდან ტიროზინაზას გაწმენდა ზომიერად უფრო რთულია სოკოს ნაყოფიერ სხეულზე მცირე რაოდენობის ქსოვილისა და ამ ქსოვილებში მელანინის უფრო დიდი რაოდენობის გამო. თანმხლები მელანინები, რომლებიც ჩვეულებრივ გროვდება ჰომოგენიზირებული ექსტრაქტის მომზადებისას, შეიძლება ფართოდ ამოღებულ იქნას ცილის ნარევიდან იონგაცვლის მასალის გამოყენებით. თავდაპირველად, ჩვენ შევეცადეთ ადსორბენტი ანიონის გადამცვლელები, ასევე ნალექის მეთოდები ამონიუმის სულფატის ნალექი ფერადი მასალის მოსაშორებლად ან ტიროზინაზის კონცენტრირებისთვის. არცერთი ეს მეთოდი არ იყო წარმატებული ფერმენტის აქტივობის აღდგენის შემცირების ან ფერადი მასალის მნიშვნელოვანი რაოდენობის ამოღების გარეშე.

მოკლედ, ნედლი ექსტრაქტები მომზადდა ჰომოგენიზაციით 100 მლ კალიუმის ფოსფატის ბუფერში (pH 5.8), რომელიც შეიცავს 1 მმ EDTA- ს. ცენტრიფუგირების შემდეგ, სუპერნატანი გამოიყენება ამონიუმის სულფატის ნალექზე. ამონიუმის სულფატის ნალექის გამოყენებით ტიროზინაზას ნაწილობრივ გამწმენდმა აჩვენა, რომ საუკეთესო ფრაქცია იყო 70% უხეშ ფერმენტთან და სხვა ფრაქციებთან მიმართებაში. მან აჩვენა ტიროზინაზას ფერმენტის მთლიანი აქტივობის, სპეციფიკური აქტივობისა და გამოსავლის მაქსიმალური მნიშვნელობები, რომელმაც მიაღწია 11.09 U/მგ, 83.5%, შესაბამისად. გაწმენდილი ფერმენტის განმეორებითი გაწმენდა იყო 3.47 როდესაც გამოიყენებოდა 70% ამონიუმის სულფატი. წინა დასკვნები იდენტური იყო, როგორც მოხსენებული ლი და სხვები. [19], რომელმაც დაადგინა, რომ ამონიუმის სულფატი 70% იყო საუკეთესო ფრაქცია, რომელიც იძლეოდა ტიროზინაზას ყველაზე მაღალი აქტივობით Solanum melongena. დიალიზირებული ამონიუმის სულფატის ნალექი, რომელიც მიმართა Sephadex G-100 გელის ფილტრაციის სვეტის ქრომატოგრაფიას აჩვენა ტიროზინაზას აქტივობის ძირითადი მწვერვალები, რომლებიც დაფიქსირდა აქტიურ ფრაქციებში და შედეგად 9.22-ჯერ გაწმენდა საბოლოო სპეციფიკური აქტივობით 29.42 U/მგ. განწმენდის საერთო აღდგენა იყო 35,7% (ცხრილი 1). ეს აქტიური ფრაქცია წაისვა DEAE- ცელულოზის სვეტზე და გამოიხატა ეტაპობრივად მზარდი NaCl გრადიენტით. ფერმენტი ამოღებულია 0–100 მმ NaCl– ზე (სურათი 1). გაჟღენთილი აქტიური ფრაქციები, რომლებიც რექრომატოგრაფიულია იმავე სვეტზე, კალიუმის ფოსფატის ბუფერის ხაზოვანი გრადიენტით (0–100 მმ) გაიარა სვეტში (სურათი 2). ამ ორსაფეხურიანი გამწმენდი სქემა, იონგამცვლელი ქრომატოგრაფია, გამოიწვია ტიროზინაზას ნაწილობრივ გაწმენდილი პრეპარატი, მიღებული 25, 26, 27 და 28 ფრაქციების გაერთიანებით და ფერმენტი გაიწმინდა დაახლოებით 16.36-ჯერ გამწმენდით 52.19 U საბოლოო სპეციფიკური აქტივობით. /მგ განწმენდის საერთო აღდგენა იყო 26,6%. ჰოროვიცი და სხვები. [20] იტყობინება, რომ ნაყოფიერ სხეულში წარმოებული ტიროზინაზა შეიძლება გამოჯანმრთელდეს და გაიწმინდოს ბლენდერში ჰომოგენიზაციით და შემდეგ გაიაროს ფრანგულ პრესაში, რასაც მოჰყვება აცეტონის ან ამონიუმის სულფატის ნალექი [21]. განახლებული ნალექი შემდგომში გაიწმინდა ერთი ან მეტი ქრომატოგრაფიული სვეტით. ყველაზე ხშირად გამოყენებული სვეტებია ჰიდროქსილაპატიტი [22], DEAE-Cellulose [23] ან DEAE Sepharose [24], სხვადასხვა სხვა იმუნოაფინური ფისები [25] და სეფადექსის ზომის გამორიცხვის გელი [21].


შედეგები

GRASP65- ურთიერთქმედების ცილების იდენტიფიკაცია ინტერფაზურ ციტოზოლში

ჩვენს წინა კვლევებში ჩვენ გამოვიყენეთ ნახევრად რაოდენობრივი მძივების აგრეგაციის ანალიზი GRASP65 ოლიგომერიზაციის ვიზუალიზაციისთვის. ჩვენ დაფარეთ Dynal M-500 მაგნიტური მძივები გაწმენდილი GRASP65- ით და გამოვიკვლიეთ მძივების აგრეგაციის ხარისხი სხვადასხვა პირობებში (ვანგ და სხვები, 2003, 2005 ტანგი და სხვები, 2010 ბ). როდესაც GRASP65 დაფარული მძივები ინკუბირებულია ფიზიოლოგიურ ბუფერში 37 ° C ტემპერატურაზე, მძივები გარკვეულწილად ქმნიან აგრეგატებს, რაც ვარაუდობს, რომ GRASP65 წარმოიქმნება ტრანს-ოლიგომერები, რომლებიც საკმარისია მეზობელი ზედაპირების ერთმანეთთან დასაკავშირებლად (ვანგ და სხვები, 2003). საინტერესოა, როდესაც მარცვლები ინკუბირებული იქნა ინტერფაზური HeLa უჯრედის ციტოზოლით, აგრეგაცია მნიშვნელოვნად გაძლიერდა იმ ბუფერთან შედარებით, რომელიც შეიცავს მსხვილფეხა რქოსანი ალბუმინის იგივე კონცენტრაციას (BSA 92.7 ± 3.5% წინააღმდეგ 34.2 ± 2.8% მძივებს აგრეგატებში სურათი 1 , A და B), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ინტერფაზური ციტოზოლი შეიცავს აქტიურ კომპონენტებს, რომლებიც აძლიერებენ GRASP65 ოლიგომერიზაციას.

ფიგურა 1: მენა ლოკალიზებულია ცის-გოლგი GRASP65– თან ურთიერთქმედების გზით. (A) GRASP65- თან შერეული Dynal M-500 მძივები ინკუბირებული იქნა BSA ან HeLa ინტერფაზის ციტოზოლის შემცველი ბუფერით. ინკუბაციის შემდეგ, მძივები მოათავსეს შუშის სლაიდებზე და შემთხვევითი ველები გადაიღეს. მასშტაბის ზოლი, 100 მკმ. (ბ) A რაოდენობის განსაზღვრა მძივების პროცენტულ ერთეულში. შედეგები გამოხატულია როგორც საშუალო ± SEM. სტატისტიკური მნიშვნელობა შეფასებულია BSA– ით დამუშავებულ მძივებთან შედარებით. ის გვ ღირებულება განისაზღვრება სტუდენტის მიერ ტესტი ***გვ & lt 0.001. (გ) GRAS65- ურთიერთქმედების ცილების აფინიტური გამწმენდი. ინტერფაზური ციტოზოლი დაყოფილია ამონიუმის სულფატის 15-30% ნალექით ინკუბაციით ან BSA ან His-GRASP65- თან ერთად CNBr მძივებით, ხოლო შეკრული ცილები გაანალიზებულია SDS-PAGE და Coomassie blue შეღებვით. ისრები მიუთითებენ მენა და β/γ-აქტინის ზოლებზე, რომლებიც ამოკვეთილი და გამოვლენილია მასის სპექტრომეტრიით. (D) BSA ან GRASP65 დაფარული მძივები ინკუბირებული იქნა 15–30% ამონიუმის სულფატის ნალექიანი ცილებით ინტერფაზური ციტოზოლიდან (I, შემავალი), გარეცხილი და გაანალიზებული ვესტერნ ბლოტით მენა. (E) იმუნოპრეციპიტაცია (IP) ან არასპეციფიკური IgG (ctrl) ან ანტი-მენა ანტისხეულები საკნების ლიზატისგან ტრანსფექტირებული საკონტროლო (ctrl) ან Mena-targeting siRNA. (F) WT HeLa უჯრედები იმუნოსტიტირებული იქნა მითითებული ანტისხეულებით, რათა ეჩვენებინათ ენდოგენური მენას გოლგის ლოკალიზაცია. (G) HeLa უჯრედები, რომლებიც გამოხატავდნენ GFP-Mena იყო იმუნოსტიტირებული GRASP65- ისთვის. (H) საკნები კონტროლირებადი ან GRASP65 siRNA ტრანსფექტირებული იყო იმუნოსტიტირებული მითითებული ცილებისთვის. GRASP65– ის შემცირებამ გააუქმა მენას გოლგის ლოკალიზაცია. (I) GFP, GFP-Mena, ან GFP-VASP ტრანსფლიცირებული უჯრედები ლიზდება და იმუნოპრეციპიტირდება GFP ანტისხეულებით. (კ) GFP-Mena- ს ან GFP-VASP- ის რაოდენობის რაოდენობრივი განსაზღვრა, რომელიც იყო coimmunoprecipitated ერთად GRASP65, GFP-Mena დონის ნორმალიზებით 100% -მდე. ***გვ & lt 0.001. (K) უჯრედები, რომლებიც გამოხატავდნენ GFP-Mena ან GFP-VASP იყო იმუნოსტიტირებული GRASP65- ისთვის. მენა მაგრამ არა VASP კონცენტრირებულია გოლგიზე. ბარი, 20 მკმ (F – H, J). (L) ვირთხის ღვიძლის გაწმენდილი Golgi (RLG) მემბრანა ინკუბაცია მოხდა ინტერფაზის (IC) ან მიტოზური (MC) ციტოზოლით ან თანმიმდევრულად ინკუბაციით MC და შემდეგ IC (MC → IC), ხელახლა იზოლირებით და დაბლოკილია მითითებული ცილებისთვის.

ინტერფაზურ ციტოზოლში აქტიური კომპონენტების არსებობის შემდგომი დასადასტურებლად, ჩვენ ჯერ გავაერთიანეთ GRASP65- ით დაფარული მძივები ინტერფაზური ციტოზოლით, შემდეგ კი გავანაწილეთ ისინი გაწმენდილი მიტოზური კინაზებით, ციკლინზე დამოკიდებული კინაზა 1 (Cdk1) და პოლოს მსგავსი კინაზა 1 (Plk1), რომლებიც ცნობილია GRASP65- ის ფოსფორილირებისთვის და მისი ოლიგომერიზაციის დარღვევისათვის (ვანგ და სხვები, 2003 2005), და შემდგომში დამუშავებული ერთჯერადი მძივები ან ინტერფაზური ციტოზოლით ან გაწმენდილი ცილის ფოსფატაზა 2A (PP2A), რომელიც დეფოსფორილირებს GRASP65 (ტანგი და სხვები, 2008). როგორც ნაჩვენებია დამატებით ფიგურაში S1A, ორივე მკურნალობამ გამოიწვია მძივის რეაქცია, მაგრამ ინტერფაზურ ციტოზოლთან მკურნალობამ გამოიწვია გაცილებით დიდი აგრეგაცია, ვიდრე PP2A– სთან, რაც მტკიცედ მიგვითითებს იმაზე, რომ ინტერფაზური ციტოზოლი შეიცავს აქტიურ კომპონენტებს GRASP65 ოლიგომერიზაციისათვის. ამ ფაქტორების ბიოქიმიური თვისებების დასახასიათებლად ჩვენ დავამუშავეთ ინტერფაზური ციტოზოლი მაღალი მარილით, სითბოთი ან პროტეაზებით. ყველა ამ მკურნალობამ გააუქმა საქმიანობა, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ ციტოზოლის ფაქტორები ცილებია (დამატებითი სურათი S1B). ნუკლეოტიდების ან მათი ანალოგების შემდგომმა ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ ეს აქტივობა მოითხოვს ATP- ს, მაგრამ არა ATP ჰიდროლიზს, რადგან არაჰიდროლიზირებადი ATP ანალოგების დამატება, როგორიცაა ATPγS, მნიშვნელოვნად აძლიერებს აგრეგაციას ATP– ს მსგავსი (დამატებითი სურათი S1C).

ჩვენ შემდეგ ვცდილობთ გავამდიდროთ ეს საქმიანობა კლასიკური ბიოქიმიური მეთოდებით. თანმიმდევრული ამონიუმის სულფატის ნალექების გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ აქტივობა გამდიდრებულია ამონიუმის სულფატის 10-30% ნალექით (დამატებითი სურათი S2A). შემდეგ ჩვენ ციტოზოლის 15–30% ამონიუმის სულფატის ნალექი გავყავით 10–35% გლიცეროლის გრადიენტით და აღმოვაჩინეთ, რომ ფრაქცია 9, სულ 12 ფრაქციას შორის, შეიცავს აქტივობის უმეტესობას (დამატებითი სურათი S2B). მოლეკულური წონის სტანდარტებთან შედარებამ აჩვენა, რომ პროტეინები მე –9 ნაწილში იყო k1000 kDa, რაც მიგვითითებს იმაზე, რომ ეს არის დიდი ცილოვანი კომპლექსი.

აქტიური კომპონენტების გასაწმენდად ჩვენ გავხსენით 15–30% ამონიუმის სულფატის ნალექი, გავაფორმეთ იგი ფიზიოლოგიურ ბუფერში და გადავიტანეთ ის სვეტში, რომელიც შეიცავს GRASP65 ან BSA ჯვარედინად დაკავშირებულ CNBr გააქტიურებულ მძივებს, რომელთაც აქვთ უფრო მაღალი ტევადობა. ვიდრე დინალის მძივები. ფართო გარეცხვის შემდეგ, შეკრული ცილები გაანალიზდა SDS -PAGE და Coomassie blue შეღებვით. ცილები, რომლებიც სპეციალურად უკავშირდება GRASP65- ს, მაგრამ არა BSA მძივებს, ამოკვეთა და გამოვლინდა მასის სპექტრომეტრიით. მენა, ძუძუმწოვრების ჰომოლოგი დროზოფილა ენა ცნობილია აქტინის ძაფის გახანგრძლივების გასაძლიერებლად (გერტლერი და სხვები, 1996) და β- და γ- აქტინი გამოვლინდა ამ პროცესში (სურათი 1C და დამატებითი ცხრილი S1).

მენა რეკრუტირებულია გოლგის მემბრანებზე GRASP65– თან ურთიერთქმედების გზით

GRASP65- სა და Mena- ს შორის ურთიერთქმედების დასადასტურებლად, ჩვენ გამოვყავით 15-30% ამონიუმის სულფატის ინტერფაზური ციტოზოლის ნაჭერი BSA- ან GRASP65- ით დაფარული CNBr გააქტიურებული მძივებით და გავაანალიზეთ შეკრული ცილები ვესტერნ ბლოტით. როგორც ნაჩვენებია დიაგრამა 1D– ში, GRASP65– მა ამოიღო მენა ციტოზოლიდან, მაგრამ BSA– მ არა. უჯრედებში ამ ურთიერთქმედების დასადასტურებლად, ჩვენ ვატარებთ მენას HeLa უჯრედის ლიზატის იმუნოპრეციპიტაციას და აღმოვაჩინეთ, რომ GRASP65, მაგრამ არა მისი ანალოგი GRASP55, მენიასთან კოპრეციპიტირებულია (სურათი 1 ე). ამ ურთიერთქმედების სპეციფიკის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ დავარტყით მენა მცირე ჩარევის რნმ -ით (siRNA). შედეგად, GRASP65 არ იყო გამოვლენილი ნალექში მენა ანტისხეულებით, როდესაც მენა ამოიწურა (სურათი 1 ე).

შემდეგ ჩვენ განვსაზღვრეთ, არის თუ არა მენა დაქირავებული გოლგიში GRASP65– ის მიერ. იმუნოფლუორესცენციის სურათები წინა მოხსენებებში ვარაუდობენ, რომ მენას აშკარა გამდიდრება ხდება კეროვან ადჰეზიებში, ლამელიპოდიასა და ფილოპოდიაში. თუმცა, სურათების უმეტესობა ასევე აჩვენებს მენის პერინუკლეარული ლოკალიზაციას უჯრედებში (დათვი და სხვები, 2002 ლურეირო და სხვები, 2002 ჯოში და ვანგი, 2015). თანმიმდევრულად, ენა და აქტინის ძაფები ბოლო დროს გამოჩნდა, რომ ლოკალიზებულია ცის-გოლგი არეგულირებს გოლგის მემბრანის შერწყმას და დაშლას ფოტორეცეპტორული უჯრედების შემუშავებაში დროზოფილა (კანანი და სხვები, 2014). იმუნოფლუორესცენციის მიკროსკოპით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ენდოგენური მენა გამდიდრებულია გოლგიზე და კოლოკალიზებულია GRASP65– ით (სურათი 1 F). ანალოგიურად, ეგზოგენურად გამოხატული მწვანე ფლუორესცენტური ცილა (GFP) - მენაც კონცენტრირებულია გოლგიზე (სურათი 1 გ). მენა გოლგის ლოკალიზაცია დამოკიდებულია GRASP65- ზე, რადგან GRASP65- ის გამოფიტვამ რნმ -ის ჩარევით (RNAi) დაარბია მენა გოლგიდან ციტოზოლში (სურათი 1H). იმის დასადგენად, არის თუ არა მენა და GRASP65 ურთიერთქმედება კონკრეტული, ჩვენ ასევე გამოვიკვლიეთ VASP, Ena/VASP ცილების ოჯახის კიდევ ერთი წევრი. GFP-Mena კოიმუნოპრეციპიტირებული იყო ენდოგენურ GRASP65– თან, მაგრამ GFP-VASP– ს ჰქონდა გაცილებით დაბალი მიდრეკილება GRASP65– თან (8.2 ± 3.3% GFP – Mena– სთან შედარებით სურათი 1, I და J). გარდა ამისა, მენასგან განსხვავებით, GFP-VASP არ იყო გამდიდრებული გოლგიზე (სურათი 1K), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ GRASP65- თან და გოლგის ლოკალიზაციასთან ურთიერთქმედება სპეციფიკურია მენასთვის. როდესაც გაწმენდილი გოლგის მემბრანა ინკუბაცია გაუკეთდა ინტერფაზას ან მიტოზურ HeLa უჯრედის ციტოზოლს და ხელახლა იზოლირდა, ციტოზოლიური მენა გოლგის მემბრანებით დაინფიცირდა როგორც ინტერფაზაში, ასევე მიტოზურ პირობებში (სურათი 1 ლ), რაც აჩვენებს, რომ GRASP65- სა და მენას შორის ურთიერთქმედება უჯრედული ციკლიდან დამოუკიდებელია.

მენა საჭიროა გოლგის ლენტის ფორმირებისათვის აქტინზე დამოკიდებული წესით

მენას ფუნქციის შესასწავლად გოლგის ორგანიზაციაში, ჩვენ დავარტყით მენა HeLa უჯრედებში (სურათი 2). საკონტროლო არასპეციფიკური siRNA– ით ტრანსფინირება არ ახდენდა მნიშვნელოვან გავლენას უჯრედში გოლგის მორფოლოგიაზე, როგორც ეს GRASP65 შეღებვით არის ნაჩვენები, ხოლო მენას გამოფიტვამ გამოიწვია გოლგის ფრაგმენტაცია, გოლგის ელემენტები ერთმანეთისგან განცალკევებული და ციტოპლაზმაში გაფანტული (სურათი 2, A – C ).ამ უჯრედების რაოდენობრივმა რაოდენობამ აჩვენა, რომ გოლგი დანაწევრებული იყო მენა-ამოწურული უჯრედების 78.2 ± 1.5% -ში, რაც მნიშვნელოვნად აღემატებოდა საკონტროლო siRNA დამუშავებულ უჯრედებს (9.0 ± 0.2% სურათი 2C). შემდეგ ჩვენ უფრო მჭიდროდ განვიხილეთ გოლგის სტრუქტურა EM– ის მიერ. საკონტროლო siRNA- ტრანსფექციურ უჯრედებში, გოლგის სტეკები კარგად იყო ორგანიზებული და გვერდით იყო დაკავშირებული ლენტში (სურათი 2D). ამის საპირისპიროდ, მენა-ამოწურულ უჯრედებში გოლგის სტეკები გათიშული იყო, მიმოფანტული მთელ ციტოპლაზმში და მნიშვნელოვნად უფრო მოკლე ვიდრე საკონტროლო უჯრედებში (სურათი 2 ე). გოლგის სტეკების საშუალო სიგრძე შემცირდა საკონტროლო უჯრედებში 1.23 ± 0.08 მკმ-დან 0.72 ± 0.05 მკმ მენამდე დაქვეითებულ უჯრედებში (სურათი 2 ე), ხოლო გოლგის დაგროვება არ შეხებია (სურათი 2F). გარდა ამისა, მენას გამოფიტულ უჯრედებში გოლგის ცისტერნები მსუბუქად გაფართოვდა, მსგავსია აქტინის დარღვევის ეფექტის მსგავსი, როგორც ადრე იყო ნათქვამი (ლაზარო-დიეგესი და სხვები, 2006). ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ მენას გამოფიტვა ამცირებს კავშირს ლენტში გოლგის დასტებს შორის.

სურათი 2: მენა არეგულირებს გოლგის მთლიანობას აქტინის პოლიმერიზაციის გზით. (A) მითითებული siRNA– ით დამუშავებული HeLa უჯრედები შეღებილია მენა და GRASP65. (ბ) HeLa უჯრედების იმუნობლოტი A.– დან A (C) A რაოდენობის განსაზღვრა უჯრედების პროცენტული ნაწილისთვის დაქუცმაცებული გოლგით. (დ) A. ისრებით აღწერილი უჯრედების EM სურათები, გოლგის დასტები. ბარი, 500 ნმ. (E) D- ის რაოდენობრივი განსაზღვრა გოლგის დასტების საშუალო ცისტერნული სიგრძისთვის. (F) D რაოდენობის განსაზღვრა ცისტერნების საშუალო რაოდენობისათვის გოლგის დასტზე. (G) მენა-ამოწურული HeLa უჯრედები გადანაწილდა cDNA– ით GFP– ით ან GFP ნიშნით, RNAi რეზისტენტული Mena WT ან მუტანტებით და შეღებილია GRASP65– ისთვის. ბარი, 20 μm (A, G). (H) უჯრედები გადანაწილდა ჯერ არასპეციფიკური (შესახვევი 1) ან მენა სპეციფიკური siRNA (შესახვევები 2-5) და შემდეგ GFP პლაზმიდით (შესახვევი 2), GFP მონიშნული, RNAi რეზისტენტული Mena WT (შესახვევი 3), ΔFAB (შესახვევი 4) და ΔGAB (შესახვევი 5) მუტანტები და გაანალიზებულია ვესტერნ ბლოტით. ენდო მენა, ენდოგენური მენა. (I) GFP- პოზიტიური უჯრედების პროცენტული რაოდენობის დაქუცმაცება გოლგით G. ***გვ & lt 0.001.

იმის უზრუნველსაყოფად, რომ გოლგის ფრაგმენტაციის ფენოტიპი სპეციფიკური იყო მენას გამოფიტვისთვის, ჩვენ გამოვხატეთ GFP-Mena– ს RNAi რეზისტენტული ფორმა, ან GFP საკონტროლოდ, უჯრედებში, რომლებშიც ენდოგენური მენა დაინგრა. როგორც ნაჩვენებია დიაგრამა 2-ში, G-I, GFP გამოხატვას არანაირი გავლენა არ აქვს დანაწევრებულ გოლგიზე, ხოლო GFP-Mena გამომხატველ უჯრედებში, გოლგი ხელუხლებელი და კომპაქტური გახდა. შემდეგ ჩვენ ვკითხეთ, არის თუ არა მენას ფუნქცია გოლგის მთლიანობაში აქტინის ძაფის ფორმირების გზით. ჩვენ გამოვხატეთ მენა ΔFAB ან ΔGAB მუტანტები, რომლებიც ვერ აკავშირებენ F- აქტინს ან G- აქტინს, შესაბამისად (ლურეირო და სხვები, 2002 Breitsprecher და სხვები, 2011), მენა-ამოწურულ უჯრედებში. ორივე მუტანტი, მიუხედავად იმისა, რომ ლოკალიზებულია გოლგიში, ვერ გადაარჩინა გოლგის ლენტი ფრაგმენტაციისგან (სურათი 2, G – I). ეს შედეგები მიუთითებს იმაზე, რომ მენა საჭიროა გოლგის მთლიანობის შესანარჩუნებლად და მისი აქტივობა დამოკიდებულია აქტინზე.

ჩვენ შემდგომ დავწერეთ ურთიერთქმედების სფეროები ორივე ცილაზე გასაშლელი ანალიზებით. Ena/VASP ცილის ოჯახის სხვა წევრების მსგავსად, Mena შეიცავს N- ტერმინალურ Ena/VASP ჰომოლოგიის 1 (EVH1) დომენს, რომელიც აკავშირებს პროლინებით მდიდარ მოტივს არაერთი ცილის ქვეუჯრედულ სამიზნეზე, პროლინებით მდიდარ საშუალო დომენზე, და C- ტერმინალური EVH2 დომენი, რომელიც ურთიერთქმედებს როგორც G- აქტინთან, ასევე F- აქტინთან და ამით აძლიერებს F- აქტინის დრეკადობას. EVH2 დომენს ასევე გააჩნია C- ტერმინალი დახვეული ხვეული დომენი, რომელიც შუამავალია მენას ტეტრამერიზაციაში (Bear and Gertler, 2009 Breitsprecher და სხვები, 2011). GRASP65, მეორეს მხრივ, შეიცავს N- ტერმინალურ GRASP დომენს და C- ტერმინალურ სერინს/პროლინს მდიდარ (SPR) დომენს (ვანგი და სხვები, 2005). იმის დასადგენად, ურთიერთქმედებს თუ არა მენა GRASP65– ით პროლინით მდიდარ დომენთან მისი EVH1 დომენის საშუალებით, ჩვენ ჩავატარეთ კვლევა გაწმენდილი ადამიანის რეკომბინანტული Mena EVH1 და ვირთხების GRASP65 ფრაგმენტების გამოყენებით. მენას EVH1 დომენი კოპირებულია სრულმეტრაჟიანი GRASP65- ით (სურათი 3A), ასევე მისი C- ტერმინალური SPR დომენით, მაგრამ არა N- ტერმინალური GRASP დომენი (სურათი 3B), რაც აჩვენებს, რომ ურთიერთქმედება პირდაპირ შუამავლობით ხდება EVH1- ით მენის დომენი და GRASP65 SPR დომენი და არის დამოუკიდებელი აქტინისგან.

სურათი 3: მენა – GRASP65 ურთიერთქმედება საჭიროა გოლგის მთლიანობისათვის. (A) BSA- ან GRASP65 დაფარული მძივები ინკუბირებული იქნა გაწმენდილი GST-Mena EVH1– ით, გარეცხილი და გაანალიზებული ვესტერნ ბლოტით GST– ისთვის. (ბ) მძივები BSA– სთან ერთად ან გაწმენდილი GRASP65 aa 1–201 (p65N) ან 202–446 (p65C) ფრაგმენტი ინკუბაცია გაწმენდილი His-Mena EVH1– ით, გარეცხილი და გაანალიზებულია Western blot– ით მისი ტეგისთვის. (C) მძივები GST– თან ერთად ან გაწმენდილი GST– ით მონიშნული GRASP65 ფრაგმენტები ინკუბირებულია HeLa უჯრედის ლიზატთან, გარეცხილია და გაანალიზებულია ვესტერნ ბლოტით მენაზე. (D) GRASP65 წერტილის მუტაციები, მითითებული ამინომჟავებით მუტაციით. (E) ვირთხის, თაგვისა და ადამიანის ამინომჟავების GRASP65 თანმიმდევრობა მითითებულ რეგიონში. თამამი ხაზები მიუთითებს იმ ადგილებზე, სადაც კონსერვირებული პროლინები მუტაციაში მუტანტებში (M1-M6), როგორც D.- ში (F) უჯრედები გადანაწილებულია GFP– ით, GFP ნიშნით GRASP65 WT, ან მითითებული მუტანტები იყო იმუნოპრეციპიტირებული ანტი- GFP ანტისხეულებით და გაანალიზებულია დასავლეთის მიერ ლაქა (G – J) GRASP65– ით ამოწურული უჯრედები გადანაწილდა WT GRASP65– ით ან მისი M2 მუტანტით და გაანალიზდა ვესტერნ ბლოტით (G) და მიკროსკოპიით (H, I). ბარი, 20 მმ. (კ) I უჯრედების რაოდენობრივი განსაზღვრა ფრაგმენტირებული გოლგით. ***გვ & lt 0.001.

გლუტათიონის გამოყენება -ტრანსფერაზა (GST) -ვირთხის GRASP65 ფრაგმენტები დატანილია მენა ქვემოთ HeLa უჯრედის ლიზატიდან, ჩვენ ვიპოვნეთ ამინომჟავები (aa) 202–320, როგორც GRASP65– ის მინიმალური ფრაგმენტი მენა სავალდებულოა (სურათი 3C). ამ რეგიონში ოთხი პროლინით მდიდარი მონაკვეთია დაცული სახეობებს შორის. ამიტომ ჩვენ შევცვალეთ კონსერვირებული პროლინები გლიცინებად (Breitsprecher და სხვები, 2011 სურათი 3, D და E), გამოხატა ისინი უჯრედებში და შეამოწმა მათი ურთიერთქმედება მენასთან კოიმუნოპრეპიტაციით. როგორც ნაჩვენებია ფიგურა 3F– ში, P236/P237/P239/P241– ის მუტაციამ ვირთხებში GRASP65 გლიცინებზე (მუტანტი M2) გააუქმა მენასთან ურთიერთქმედება, ხოლო სხვა პროლინების მუტაციას არანაირი ეფექტი არ აქვს. ეს Mena EVH1 სავალდებულო თანმიმდევრობა GRASP65, L (ადამიანი)/P (ვირთხა და თაგვი) PPxPxP, თუმცა ახლოსაა საერთო F/LPPXP თანმიმდევრობით, რომელსაც იზიარებს რამდენიმე განსხვავებული დროზოფილა ენა და ძუძუმწოვრები მენა ურთიერთქმედების ცილები (ბურთი და სხვები, 2002), არატრადიციული, მსგავსია სხვა Mena EVH1- სავალდებულო მოტივის ადამიანის აბიში (Breitsprecher და სხვები, 2011).

იმის დასადგენად, საჭიროა თუ არა GRASP65 – მენა ურთიერთქმედება მენა გოლგის ლოკალიზაციისა და გოლგის ლენტის მთლიანობისთვის, ჩვენ გადავიტანეთ GFP ნიშნით ველური ტიპის (WT) ვირთხა GRASP65 ან მენა ურთიერთქმედება-დეფიციტური მუტანტი M2 GRASP65– ით დაქვეითებული HeLa უჯრედებში (სურათი 3, G და ჯ) განსხვავებით WT GRASP65- ისგან, M2 მუტანტმა ვერ მოახერხა მენას გოლგიში გადაყვანა (სურათი 3H) ან გადაარჩინა დანაწევრებული გოლგი (სურათი 3, I და J).

ვინაიდან მენა არეგულირებს გოლგის სტრუქტურას აქტინის ძაფებთან ურთიერთქმედებით, ჩვენ ვკითხეთ, გავლენას მოახდენს თუ არა აქტინის ძაფების შემაშფოთებელი მოქმედება გოლგის სტრუქტურაზე. ცნობილია, რომ ციტოქალაზინ B- ს აქვს აქტინის ძაფის თავსახური და, შესაბამისად, აფერხებს აქტინის ძაფის გახანგრძლივებას, ანტაგონიზირებს მენას აქტინის ძაფის დაფარვის თავიდან ასაცილებლად (ბრაეტი და სხვები, 1996). ლატრუნკულინი B აკავშირებს აქტინის მონომერს და ამით დეპოლიმერიზებს აქტინის ძაფებს (ვაკაწუკი და სხვები, 2001). ამ ექსპერიმენტებში ჩვენ არ შევამჩნიეთ აშკარად შედედებული გოლგი, როგორც ადრე იყო ნათქვამი (ლაზარო-დიეგუესი და სხვებინაცვლად ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ციტოჩალაზინ B- ით ან ლატრუნკულინ B- ით დამუშავებულმა უჯრედებმა გამოავლინეს ფხვიერი და დაუკავშირებელი გოლჯის ფენოტიპი დიმეთილ სულფოქსიდში (DMSO) დამუშავებულ უჯრედებში ხელუხლებელ გოლგთან შედარებით (სურათი 4A). გარდა ამისა, siRNA– ს მიერ უჯრედული β- ან γ- აქტინის შემცირებამ გამოიწვია გოლგის ფრაგმენტაცია (სურათი 4 ბ), მსგავსი მენას შემცირების მსგავსი. EM– ის მიერ აღმოვაჩინეთ, რომ აქტინის ძაფების დარღვევა მედიკამენტური მკურნალობით (სურათი 4C) და β- ან γ- აქტინის შემცირება (სურათი 4D) ორივემ გამოიწვია მინისტრების გაფანტვა, რაც აშკარად გამოწვეულია გოლგის ლენტის დაუკავშირებლობით. ერთად მიღებულმა შედეგებმა გამოავლინა, რომ მენა და აქტინის ძაფები არეგულირებენ გოლჯის ლენტის მთლიანობას.

სურათი 4: აქტინის ძაფები საჭიროა გოლგის მთლიანობისათვის. (A) HeLa უჯრედები დამუშავებული DMSO, ციტოქალაზინ B (CytB, 40 μM), ან latrunculin B (LatB, 0.5 μM) 2 საათის განმავლობაში შეღებეს α-mannosidase II (ManII) და როდამინით მარკირებული ფალოიდინით. (ბ) მითითებული siRNA– ით ტრანსფლირებული უჯრედები შეღებილი იქნა ManII– ს და როდაამინ – ფალოიდინისთვის. ბარი, 20 მკმ (A, B). (C) DMSO, ციტოქალაზინ B ან ლატრუნკულინი B უჯრედებით დამუშავებული უჯრედები 2 საათის განმავლობაში დამუშავდა EM და გამოსახულ იქნა. ისრები მიუთითებს გოლგის დასტებს. გოლგის დასტების საშუალო ცისტერნალური სიგრძე გამოითვალა. სტატისტიკური მნიშვნელობა შეფასდა DMSO- ით დამუშავებულ უჯრედებთან შედარებით. საკონტროლო, β-აქტინის ან γ-აქტინის სირნმ-ით 48 საათის განმავლობაში გადატანილი უჯრედები დამუშავდა EM- ისთვის და გაანალიზდა როგორც C. სტატისტიკური მნიშვნელობა შეფასდა საკონტროლო სირნმ-ით დამუშავებულ უჯრედებთან შედარებით. ბარი, 500 ნმ (C, D). ***გვ & lt 0.001.

აქტინის ძაფები ჩართულია უჯრედშიდა ტრეფიკინგში (კამპელონი და სხვები, 2008 მისერი-ლენკეი და სხვები, 2010 ეგეა და სხვები, 2013 გურელი და სხვები, 2014) და, შესაბამისად, ჩვენ დავადგინეთ, მოქმედებს თუ არა მენა, როგორც აქტინის ძაფის მარეგულირებელი, ასევე ცილების ტრეფიკინგზე, ვეზიკულური სტომატიტის ვირუსის გლიკოპროტეინის (VSV-G) ტვირთის სახით. საკნები, რომლებიც პირველად გადაყვანილ იქნა კონტროლით ან Mena siRNA დაინფიცირდა ადენოვირუსებით, რომლებიც წინასწარ იყო შეფუთული VSV-G-ts045-GFP პლაზმიდებით (Xiang და სხვები, 2013). უჯრედები ინახებოდა ღამით არა 40 % C ტემპერატურაზე VSV-G-ts045 ენდოპლაზმულ ბადეში (ER) და შემდეგ გადავიდა ნებადართულ ტემპერატურაზე (32 ºC), რათა VSV-G- ის ექსპორტირება ER– დან გოლგის გავლით პლაზმურ მემბრანაში. (პრესლი და სხვები, 1997 ჰირშბერგი და სხვები, 1998). როგორც ნაჩვენებია დამატებით სურათზე S3, მენას გამოფიტვა მნიშვნელოვნად არ ახდენს გავლენას VSV-G ტრეფიკინგზე. ამრიგად, მენა გადამწყვეტ როლს ასრულებს გოლჯის ლენტის ფორმირებაში, მაგრამ არა ცილების ტრეფიკინგში.

მენა და აქტინის ძაფები აადვილებს გოლჯის ლენტის წარმოქმნას ნოკოდაზოლის დაბანის შემდეგ

ძუძუმწოვრების უჯრედებში გოლგის ლენტის ფორმირება მოითხოვს ხელუხლებელი მიკროტუბულების ქსელს. ნოკოდაზოლით მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაცია იწვევს გოლგის მსახურებებს ციტოპლაზმაში გაფანტვით (მინინი, 1997 ტიბერგი და მოსკალევსკი, 1999). შემდეგ ჩვენ გავრეცხეთ ნოკოდაზოლი, რათა გოლგის ლენტის რეფორმაცია მიბაძოს პოსტმიტოტიკურ გოლგის შეკრებას მენის თანდასწრებით ან არყოფნით. როგორც ნაჩვენებია სურათი 5, გოლგის ლენტის რეფორმა მნიშვნელოვნად შეფერხდა მენა-ამოწურულ უჯრედებში საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით (სურათი 5A). ყოველ მომენტში, იყო უფრო თავისუფალი გოლგის ელემენტები, რომლებიც არ იყო შერწყმული გოლგის ბირთვთან მენა-ამოწურულ უჯრედებში. ნოკოდაზოლის მოხსნიდან 120 წუთის შემდეგ, გოლგის ყველა ელემენტი კონცენტრირებული იყო უჯრედის ცენტრში და გოლგის ლენტი უცვლელი დარჩა ყველა საკონტროლო უჯრედში. ისინი დარჩნენ დაუკავშირებელნი. კონფოკალური ვიზუალიზაცია და რაოდენობრივი მაჩვენებლები აჩვენებს, რომ მენას გამოფიტვამ გაზარდა გოლგის ელემენტების რაოდენობა უჯრედზე, რაც მიუთითებს გოლგის ელემენტების შერწყმის დეფექტზე (სურათი 5 ბ). მენას შემცირების მსგავსად, ციტოქალაზინ B– ით აქტინის გახანგრძლივების დათრგუნვამ ასევე დააყოვნა გოლჯის ლენტის რეფორმა ნოკოდაზოლის მოცილების შემდეგ (სურათი 5C და დამატებითი სურათი S4). ამრიგად, მენა და აქტინის ძაფის გახანგრძლივება აუცილებელია გოლგის სტეკების ლენტთან დასაკავშირებლად.

სურათი 5: მენას გამოფიტვა აფერხებს გოლგის შეკრებას ნოკოდაზოლის გამორეცხვის შემდეგ. (A) საკონტროლო ან Mena siRNA ტრანსფექტირებული HeLa უჯრედები ინკუბირებული იყო ნოკოდაზოლით 2 საათის განმავლობაში. ნოკოდაზოლის მოხსნის შემდეგ მითითებული დროით (წუთი), უჯრედები დაფიქსირდა და შეღებილი იქნა ფალოიდინით და GRASP65 ანტისხეულებით. ბარი, 10 მმ. (ბ) A– ში ჩატარებული ექსპერიმენტები გაანალიზებულია კონფოკალური მიკროსკოპით და მითითებულია უჯრედებში გოლგის ნაწილაკების რაოდენობა (საშუალო ± SEM). *გვ & lt 0.05 ***გვ & lt 0.001. (C) უჯრედები ინკუბირებული იქნა ჯერ ნოკოდაზოლით 2 საათის განმავლობაში, შემდეგ კი DMSO- ს ან ციტოქალაზინ B- ს დამატებით კიდევ 30 წუთის განმავლობაში. უჯრედები გარეცხილი და შემდგომ ინკუბირებული იქნა ზრდის გარემოში, რომელიც შეიცავს DMSO- ს ან ციტოქალაზინ B- ს, მაგრამ არა ნოკოდაზოლს, მითითებული დროის განმავლობაში. უჯრედები შეღებილია GRASP65- ისთვის და ფალოიდინისთვის (სურათები ნაჩვენებია დამატებით სურათებში S4 და S5) და გაანალიზებულია კონფოკალური მიკროსკოპით და რაოდენობრივად, როგორც B. რაოდენობრივი შედეგები.

როგორც კონდილისმა შემოგვთავაზა და სხვები (2007), როდესაც დაარბია ნოკოდაზოლით მკურნალობა, გოლგის სტეკები არსებობს წყვილების სახით ძუძუმწოვრების უჯრედებში, მსგავსია დროზოფილა S2 უჯრედები და აქტინის ძაფები საჭიროა გოლგის წყვილების ფორმირებისათვის. ამიტომ ნოტროდაზოლით დამუშავებულ უჯრედებში ლატრუნკულინის B მიერ აქტინის ძაფების დეპოლიმერიზაციამ უნდა გამოიწვიოს გოლგის წყვილების გახლეჩა და გოლგის ელემენტების გაორმაგება. ამ შესაძლებლობის შესამოწმებლად, ჩვენ ინკუბირებული გვაქვს უჯრედები ნოკოდაზოლით DMSO- ს, ციტოკალაზინის B ან ლატრუნკულინ ბ -ს თანდასწრებით. კონფოკალური მიკროსკოპის ანალიზმა აჩვენა, რომ ნოკოდაზოლით მკურნალობამ გოლგის ლენტი გააფანტა მინისტრაციებში, თუმცა ციტოჩალაზინ B- ს დამატებითმა მკურნალობამ არ გაზარდა გოლგის ელემენტები. ანალოგიურად, siRNA– ს მიერ მენას შემცირება გავლენას არ ახდენს გოლგის ელემენტების რაოდენობაზე ნოკოდაზოლით დამუშავებულ უჯრედებში (დამატებითი სურათი S5A). EM– ის თანახმად, ნოკოდაზოლით დამუშავებულ უჯრედებში გოლგის დასტები იყო უფრო მოკლე ვიდრე ჩვეულებრივ ინტერფაზურ უჯრედებში და ყოველთვის განლაგებული იყო ER მემბრანების მიმდებარედ, სავარაუდოდ ER გასასვლელი ადგილებიდან. არც მენას დაქვეითებამ, არც ციტოქალაზინ B- მ და ლატრუნკულინ B– ს მკურნალობამ არ იმოქმედა გოლგის მინისტრების სიგრძეზე და მდებარეობაზე (დამატებითი სურათი S5B). ამ შედეგებმა აჩვენა, რომ გოლგის დაწყვილება ნაკლებად სავარაუდოა, რომ იყოს მენას და აქტინის შუამავლობით ლენტის დამაკავშირებელი მექანიზმი.

მენა და აქტინის ძაფები საჭიროა გოლგის შერწყმისთვის

ნოკოდაზოლის მოცილების შემდეგ გოლგის ლენტის რეფორმირებისას, ჩვენ ხშირად ვაკვირდებოდით აქტინის ლაქებს, რომლებიც ლოკალიზებულია საკონტროლო უჯრედებში გოლგის ელემენტთა ირგვლივ და მათ შორის (სურათი 6A), რაც, შესაძლოა, გოლგის სტეკებს ერთმანეთთან დაკავშირების საშუალებას აძლევს იშვიათად იყო გამოვლენილი (სურათი 6 ბ). იმის გამო, რომ გოლგის ლენტი უკავშირდება მემბრანის შერწყმის აქტივობას, ჩვენ დავადგინეთ, ხელს უწყობს თუ არა მენას შუამავლობით აქტინის გახანგრძლივება გოლგის მემბრანის შერწყმას, კარგად შემუშავებული ინ ვიტრო გოლგის ხელახალი შეკრების ანალიზის გამოყენებით (ტანგი და სხვები, 2010a). ჩვენ პირველად გავწმინდეთ გოლგის გარსები მიტოზური HeLa უჯრედის ციტოზოლით, რათა გამოიწვიოს გოლგის ფრაგმენტაცია. ჩვენ ხელახლა განვათავსეთ მიტოზური გოლგის ფრაგმენტები (MGF) და შემდგომ დავამუშავეთ ისინი ინტერფაზური ციტოზოლით, რათა ბუშტუკები შერწყმდეს. ჩვენ შემდეგ გავზომეთ გოლგის მემბრანის შერწყმის აქტივობა ბუშტუკებისგან წარმოქმნილი გრძელი ცისტერნალური გარსების რაოდენობრივი განსაზღვრის გზით. იმის დასადგენად, საჭიროა თუ არა მენა გოლგის მემბრანის შერწყმისთვის, ჩვენ იმუნოდეფიცირებული გავუშვით მენა ინტერფაზური ციტოზოლისგან. როდესაც კონტროლირებადი იმუნოგლობულინით G (IgG) - ციტოზოლით ინკუბაცია მოხდა, მიტოზური გოლგის ფრაგმენტები (სურათი 6C) ხელახლა შეიკრიბა გრძელი, დაწყობილი გოლგის ცისტერნაში (სურათი 6D). თუმცა, როდესაც მენა ამოიწურა, რომელმაც ამოიღო მენა 85.5% ციტოზოლიდან, მემბრანის შერწყმის აქტივობა შემცირდა საკონტროლო ციტოზოლის 35.1 ± 7.7% -მდე (სურათი 6, E -G). ანალოგიურად, აქტინის დეპოლიმერიზაციამ ციტოქალაზინ B- ს შეკრების რეაქციაში დამატებით შეამცირა მემბრანის შერწყმის ეფექტურობა 29,7 ± 7,1% -მდე DMSO კონტროლთან შედარებით (სურათი 6H). ამრიგად, მენა და აქტინი აუცილებელია გოლგის მემბრანის შერწყმისთვის.

სურათი 6: მენა არეგულირებს გოლგის მემბრანის შერწყმას F- აქტინის გახანგრძლივების გზით. (A, B) HeLa უჯრედები გადანაწილდა საკონტროლო (A) ან Mena (B) siRNA და ინკუბაცირებული ნოკოდაზოლით 2 სთ. ნოკოდაზოლის ამოღებიდან 15 წუთის შემდეგ უჯრედები შეღებეს აქტინისთვის (წითელი) და GRASP65 (თეთრი) და გაანალიზებულია კონფოკალური მიკროსკოპით. ნაჩვენებია ერთჯერადი სკანირება სურათების ნაწილები გადიდებული, რათა ნახოთ გოლჯის გარსებს შორის არსებული აქტინის ლაქები. ბარები, 10 მმ. (გ) მენა ეფექტურად გამოიფიტა ინტერფაზური ციტოზოლიდან, როგორც ეს ნაჩვენებია ვესტერნ ბლოტში. (D – F) ინ ვიტრო გოლგის ხელახალი ათვისება. გაწმენდილი RLG გარსები დაიშალა მიტოზური ციტოზოლის დამუშავებით, ხელახლა იზოლირებული (D) და შემდგომი ინკუბაციით ინტერფაზური ციტოზოლით იმუნოდეფიცირებული საკონტროლო IgG (E) ან ანტი-მენა ანტისხეულებით (F). მემბრანები დამუშავებულია EM- ისთვის და გამოსახულია. ბარები, 500 ნმ. (ზ) გოლგის მემბრანის შეფარდების ეფექტურობის რაოდენობრივი განსაზღვრა E და F. ***გვ & lt 0.001. (თ) გაწმენდილი გოლგის მემბრანა, რომელიც ჯერ დაიშალა მიტოზური ციტოზოლის დამუშავებით და შემდეგ ინკუბაცია გაუკეთდა ინტერფაზურ ციტოზოლს DMSO- ს ან 40 μM ციტოქალაზინ B- ს (CytB) თანდასწრებით. მემბრანები დამუშავდა EM- ისთვის და რაოდენობრივად, როგორც გ.

მენა და მოგრძო აქტინის ძაფები აძლიერებს GRASP65 ოლიგომერიზაციას

იმის გამო, რომ მენა პირდაპირ ურთიერთობს GRASP65– თან და მენა ხელს უწყობს აქტინის გახანგრძლივებას გოლგის დასტების ლენტად დასაკავშირებლად, ჩვენ ვკითხეთ, მოქმედებს თუ არა GRASP65 მხოლოდ მემბრანის წამყვანად მენაზე ან მენაზე და აქტინის ძაფები ასევე არეგულირებს GRASP65 ოლიგომერიზაციას. ეს შეკითხვა მიმართული იყო მძივის აგრეგაციის ანალიზის გამოყენებით, რომლის დროსაც GRASP65 ოლიგომერიზაცია შეიძლება პირდაპირ ვიზუალიზებული იყოს (ვანგ და სხვები, 2003 2005). როგორც ნაჩვენებია ფიგურაში 7, A და B, GRASP65- ით დაფარული მძივები ქმნიან დიდ აგრეგატებს ინტერფაზური ციტოზოლით დამუშავებისას, ხოლო მენა ციტოზოლიდან შემცირებით მნიშვნელოვნად ამცირებს ამ აქტივობას, რაც იმაზე მიგვანიშნებს, რომ მენა ინტერფაზის ციტოზოლის ერთ-ერთი მთავარი კომპონენტია. რომლებიც აძლიერებენ GRASP65 ოლიგომერიზაციას (სურათი 7, A და B). GRASP65- ის ჰიპერპოლიმერიზაცია მოითხოვს აქტინის პოლიმერიზაციას, რადგან რეაქციაში ციტოქალაზინ B- ს დამატება მნიშვნელოვნად ამცირებს GRASP65 მძივის აგრეგაციას DMSO კონტროლთან შედარებით (სურათი 7, C და D).

სურათი 7: მენა და F- აქტინები აძლიერებენ GRASP65 ოლიგომერიზაციას. (A, B) GRASP65- ით დაფარული მძივები ინკუბირებული იქნა ინტერფაზური ციტოზოლით (IC) იმუნოდპლეტირებული არასპეციფიკური ან ანტი-მენა IgG საშუალებით. მძივები გადაღებულია მიკროსკოპით (A), ხოლო მძივების პროცენტი აგრეგატებში რაოდენობრივად (B). (C, D) GRASP65 დაფარული მძივები ინკუბირებული იქნა IC– ით DMSO– ს ან 40 μM ციტოქალაზინ B– ს თანდასწრებით და შედეგები რაოდენობრივად დაფიქსირდა. (E, F) GRASP65- ით დაფარული მძივები, რომლებიც ინკუბირებულია მითითებული გაწმენდილი ცილებით ან IC- ით, გამოსახული და რაოდენობრივია. (G, H) GRASP65- ით დაფარული მძივები, რომლებიც ინკუბირებულია ინტერფაზური ციტოზოლით ან ინტერფაზური ციტოზოლით, რომელიც წინასწარ იყო ინკუბაცირებული BSA, Mena EVH1, domain ან Mena EVH2 დომენით, იქნა გამოსახული და რაოდენობრივი. ბარები, 50 მმ. ***გვ & lt 0.001.

ალბათ საუკეთესო გზა იმის შესამოწმებლად, თუ როგორ არეგულირებენ მენა და აქტინი GRASP65 ოლიგომერიზაციას, არის GRASP65 დაფარული მძივების ინკუბაცია გაწმენდილი მენა და აქტინით, თუმცა, სრულმეტრაჟიანი მენის გამოხატვისა და გაწმენდის მცდელობა წარუმატებელი აღმოჩნდა და ჩვენ შევძელით მხოლოდ მენის ფრაგმენტების გაწმენდა. ამიტომ ჩვენ პირველად დავადგინეთ, შეუძლია თუ არა მენას ფრაგმენტებს გაზარდოს GRASP65 ოლიგომერიზაცია.როგორც ნაჩვენებია ფიგურაში 7, E და F, EVH1 დომენი, რომელიც ურთიერთქმედებს GRASP65– თან (სურათი 3A), მაგრამ არ უწყობს ხელს აქტინის პოლიმერიზაციას აქტინის პოლიმერიზაციის დომენის არარსებობის გამო, არ გაზრდის GRASP65 მძივის აგრეგაციას. ანალოგიურად, EVH2 დომენმა, რომელიც ხელს უწყობს აქტინის პოლიმერიზაციას, მაგრამ არ უკავშირდება GRASP65- ს, ასევე არ გააძლიერა GRASP65 ოლიგომერიზაცია. ჩვენ შემდეგ შევამოწმეთ, შეიძლება თუ არა მენას ფრაგმენტების დამატება ინტერფაზურ ციტოზოლში, შეაფერხოს GRASP65 ოლიგომერიზაცია, რომელიც ხელს უწყობს მენა. მართლაც, გაწმენდილი EVH1 დომენის დამატება რეაქციაში, რომელიც კონკურენციას უწევს მენას ციტოზოლში GRASP65- ის შეკავშირების მიზნით, მნიშვნელოვნად შეამცირა აქტივობა ინტერფაზურ ციტოზოლში GRASP65- ით დაფარული მძივების აგრეგაციის ხელშეწყობის მიზნით. EVH2 დომენს, რომელიც ცნობილია კონკურენცია გაუწიოს აქტინს, მსგავსი ეფექტი ჰქონდა. როგორც უარყოფითი კონტროლი, BSA– ს არანაირი გავლენა არ ჰქონია GRASP65 ოლიგომერიზაციაზე (სურათი 7, G და H). ეს შედეგები აჩვენებს, რომ ორივე GRASP65 ურთიერთქმედება და აქტინის გახანგრძლივება აქტიურობაა საჭირო მენასთვის GRASP65 ოლიგომერიზაციის გასაძლიერებლად და გოლგის ლენტით დამაკავშირებლად.

შედეგების ერთად მიღებით, ჩვენ გამოვყავით მენა, როგორც ახალი GRASP65- ის შემკვრელი პარტნიორი, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს გოლჯის ლენტის ფორმირებაში. ეს განმარტავს, თუ როგორ თამაშობს GRASP65 ორმაგ როლს გოლგის სტრუქტურის ფორმირებაში. როდესაც მდებარეობს გოლგის ცისტერნაებს შორის, GRASP65 ოლიგომერები პირდაპირ აკავშირებენ მიმდებარე ცისტერნებს დასტებად. როდესაც მდებარეობს გოლგის დასტების რგოლებზე, GRASP65 მენა უბიძგებს მენა გოლგიზე უშუალო ურთიერთქმედების გზით და იწვევს ადგილობრივ აქტინის ძაფის ზრდას. შემდგომში, აქტინის ბოჭკოები კვეთს GRASP65- ს და ხელს უწყობს GRASP65 ოლიგომერიზაციას. ორივე აქტინის ძაფები და GRASP65 ოლიგომერები წარმოქმნიან ძალებს მეზობელი გოლგის დასტების ლენტთან დასაკავშირებლად (სურათი 8).

ფიგურა 8: მენა – GRASP65 ურთიერთქმედების მოდელი გოლგის ლენტით დამაკავშირებელი. გოლგის მინისტრები უჯრედის ცენტრში გადადიან მიკროტუბულების გასწვრივ (1). GRASP65 ოლიგომერები zipper Golgi cisternae შევიდა stacks (2) და აკავშირებს მიმდებარე Golgi stacks შევიდა ლენტი (3). ლენტის ფორმირება თავდაპირველად მოითხოვს მენა GRASP65– ის მენიას გოლგიში, რაც ხელს უწყობს აქტინის ძაფის გახანგრძლივებას (4). შემდეგ აქტინის ბოჭკოები აკავშირებენ გაბნეულ გოლგის დასტებს და ერთმანეთისკენ უბიძგებენ ლენტის შესაქმნელად (5). ორივეზე ცის და ტრანს დასტის სახეები, გოლჯისთან ასოცირებული აქტინის ძაფები შეიძლება ხელი შეუწყოს მემბრანის დეფორმაციას ვეზიკულების წარმოქმნის, გახლეჩისა და შერწყმისათვის და მოკლე მანძილზე მოძრაობისათვის (6).


ამონიუმის სულფატის ნალექების ანალიზი pH დამოკიდებულება - ბიოლოგია

ლოურის პროცედურის მგრძნობელობა ზომიერად მუდმივია პროტეინიდან პროტეინამდე და ის იმდენად ფართოდ იქნა გამოყენებული, რომ ლოურის პროტეინის შეფასებები არის აბსოლუტურად მისაღები ალტერნატივა მკაცრი აბსოლუტური განსაზღვრისათვის თითქმის ყველა იმ გარემოებაში, როდესაც ჩართულია ცილის ნარევები ან ნედლი ექსტრაქტები.

მეთოდი ემყარება როგორც ბიურეტის რეაქციას, სადაც ცილების პეპტიდური ობლიგაციები რეაგირებენ სპილენძთან ტუტე პირობებში წარმოქმნიან Cu+, რომელიც რეაგირებს ფოლინის რეაგენტთან, ასევე ფოლინ-ციოკალტეს რეაქცია, რომელიც ცუდად არის გასაგები, მაგრამ არსებითად ფოსფომოლიბდონგსტატი მცირდება ჰეტეროპოლიმოლიბდენი ცისფერი არომატული ამინომჟავების სპილენძით კატალიზირებული ჟანგვით. რეაქციები იწვევს ძლიერ ლურჯ ფერს, რომელიც ნაწილობრივ დამოკიდებულია ტიროზინისა და ტრიპტოფანის შემცველობაზე. მეთოდი მგრძნობიარეა დაახლოებით 0.01 მგ ცილა/მლ და საუკეთესოდ გამოიყენება ხსნარებზე კონცენტრაციებით 0.01-1.0 მგ/მლ ცილის დიაპაზონში.

1. კომპლექსური ფორმირების რეაქტივი : მოამზადეთ უშუალოდ გამოყენებამდე შემდეგი სამი მკვრივი ხსნარის შერევით A, B და C პროპორციით 100: 1: 1 (v: v: v), შესაბამისად.
ხსნარი A: 2% (w/v) Na2CO3 გამოხდილ წყალში.
ხსნარი B: 1% (წ/ვ) CuSO4& middot5H2ო გამოხდილ წყალში.
ხსნარი C: 2% (w/v) ნატრიუმის კალიუმის ტარტრატი გამოხდილ წყალში.
2. 2N NaOH .
3. ფოლინის რეაგენტი (კომერციულად ხელმისაწვდომი). განზავდეს 1: 2 H- ში2O გამოყენებამდე.
4. სტანდარტები : გამოიყენეთ სტანდარტული ცილის მარაგიანი ხსნარი (მაგ., ძროხის შრატის ალბუმინის ფრაქცია V), რომელიც შეიცავს 4 მგ/მლ ცილას გამოხდილ წყალში, რომელიც ინახება გაყინულ ტემპერატურაზე -20 & degC. მოამზადეთ სტანდარტები გამოხდილი წყლით განზავებული შემდეგნაირად:

საფონდო ხსნარი., ul 0 1.25 2.5 6.25 12.5 25 62.5 125 250
წყალი, ul 500 499 498 494 488 475 438 375 250
Prot.conc., Ug/ml 0 10 20 50 100 200 500 1000 2000 2000

1. 0.2 მლ ნიმუშს ან სტანდარტს დაამატეთ 1 მლ ახლად შერეული კომპლექსური ფორმირების რეაქტივი. დატოვე ხსნარი ოთახის ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში

2. დაამატეთ 0.1 მლ განზავებული ფოლინის რეაქტივი, მორევის მიქსერის გამოყენებით და ნარევი დადგით ოთახის ტემპერატურაზე 30-60 წთ (არ აღემატებოდეს 60 წთ)

3. წაიკითხეთ შთანთქმის მაჩვენებელი 750 ნმ -ზე, თუ ცილის კონცენტრაცია იყო 500 მგ/მლ -ზე ნაკლები ან 550 ნმ -ზე, თუ ცილის კონცენტრაცია იყო 100 -დან 2000 მკგ/მლ -მდე.

4. შეადგინეთ შთანთქმის სტანდარტული მრუდი, როგორც ცილის საწყისი კონცენტრაციის ფუნქცია და გამოიყენეთ იგი ცილის უცნობი კონცენტრაციის დასადგენად.

1. თუ ნიმუში შესაძლებელია ნალექის სახით, მაშინ დაითხოვეთ ნალექი 2N NaOH- ში.

2. პეტერსონი აღწერილია ნალექის საფეხური, რომელიც იძლევა ცილის ნიმუშის გამოყოფას შემაფერხებელი ნივთიერებებისგან და, შესაბამისად, ახდენს ცილის ნიმუშის კონცენტრაციას, რაც საშუალებას იძლევა განისაზღვროს ცილები განზავებულ ხსნარში. პეტერსონის ნალექების საფეხური შემდეგია:
ა დაამატეთ 0,1 მლ 0,15% დეოქსიქოლატი 1,0 მლ ცილის ნიმუშს.
ბ მორევა და დადგით ოთახის ტემპერატურაზე 10 წთ.
გ დაამატეთ 0.1 მლ 72% TCA, მორევი და ცენტრიფუგა 10000 rpm 30 წუთის განმავლობაში.
დ გადაიტანეთ ზეწარი და შემდეგ დაითხოვეთ გრანული 2N NaOH- ში.

3. რეაქცია ძალიან pH- ზეა დამოკიდებული და ამიტომ მნიშვნელოვანია pH- ის შენარჩუნება 10-დან 10.5-მდე. ამიტომ ფრთხილად იყავით იმ ნიმუშების გაანალიზებისას, რომლებიც იმყოფებიან ძლიერ ბუფერში ამ დიაპაზონის მიღმა.

4. ინკუბაციის პერიოდი არ არის კრიტიკული და შეიძლება განსხვავდებოდეს 10 წუთიდან რამდენიმე საათამდე, საბოლოო შეწოვაზე ზემოქმედების გარეშე.

5. Vortex ნაბიჯი გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს რეპროდუქციული შედეგების მისაღებად. ფოლინის რეაგენტი მხოლოდ მცირე ხნით არის რეაქტიული ამ ტუტე პირობებში, არასტაბილურია ტუტეში და ამიტომ დიდი სიფრთხილე უნდა იქნას მიღებული საფუძვლიანი შერევის უზრუნველსაყოფად.

6. ანალიზი არ არის წრფივი უფრო მაღალ კონცენტრაციებზე. ამიტომ, დარწმუნდით, რომ აანალიზებთ თქვენს ნიმუშს კალიბრაციის მრუდის ხაზოვან ნაწილზე.

7. ანალიზების თითოეულ ჯგუფს სჭირდება სტანდარტების ერთობლიობა, სასურველია დუბლიკატი. რეკომენდებულია უცნობი დუბლიკატი ან სამჯერ.

8. ლოურის მეთოდის ერთი მინუსი არის ის ფაქტი, რომ რიგი ნივთიერებები ერევა ამ ანალიზში, მათ შორის ბუფერები, წამლები, ნუკლეინის მჟავები და შაქარი. ხშირ შემთხვევაში, ამ აგენტების ეფექტი შეიძლება შემცირდეს მათი განზავებით, იმ ვარაუდით, რომ ცილის კონცენტრაცია საკმარისად მაღალია, რათა განისაზღვროს განზავების შემდეგ. როდესაც ჩარევის ნაერთები მონაწილეობენ, რა თქმა უნდა, მნიშვნელოვანია შესაბამისი ბლანკის გაშვება. სარეცხი საშუალებებით, საქაროზით და EDTA– ით გამოწვეული ჩარევა შეიძლება აღმოიფხვრას SDS– ს დამატებით. ამ შემთხვევაში საუკეთესო ალტერნატივაა Lowry-TCA (იხ. პროტეინის ნალექების პროტოკოლები) ან პეტერსონის გაკეთება.

9. მოხსენებულია ცვლილებები ამ ძირითად ანალიზში, რაც ზრდის რეაქციის მგრძნობელობას. თუ ფოლინის რეაგენტი დაემატება ორ ნაწილად, ყოველ დამატებას შორის მორევა, მიიღწევა მგრძნობელობის 20% -იანი ზრდა. ფოლინის რეაგენტის დამატებიდან 3 წუთის შემდეგ დითიოთრეიტოლის დამატება ზრდის მგრძნობელობას 50%-ით.

10. ამ ანალიზში წარმოქმნილი ფერის რაოდენობა ნებისმიერი მოცემული ცილის (ან ცილების ნარევის) მიხედვით დამოკიდებულია ცილის (ებ) ის ამინომჟავების შემადგენლობაზე (იხ. შესავალი). ამრიგად, ორ განსხვავებულ პროტეინს, თითოეულს მაგალითად 1 მგ/მლ კონცენტრაციით, შეუძლია მიიღოს განსხვავებული ფერი ამ ანალიზში. აქედან გამომდინარე, უნდა დაფასდეს, რომ BSA- ს (ან სხვა ნებისმიერი ცილის) სტანდარტად გამოყენება მხოლოდ ცილის კონცენტრაციის სავარაუდო მაჩვენებელს იძლევა. ერთადერთი დრო, როდესაც ეს მეთოდი იძლევა აბსოლუტურ მნიშვნელობას ცილის კონცენტრაციისთვის არის ის, როდესაც გასაანალიზებელი ცილა ასევე გამოიყენება სტანდარტული მრუდის ასაგებად. ყველაზე ზუსტი გზა ნებისმიერი ცილის ხსნარის კონცენტრაციის დასადგენად არის ამინომჟავების ანალიზი.

ჩარევის რეაგენტები ლოურისთვის

ბევრი სარეცხი საშუალება, შარდოვანა, გუანიდინის HCl, მაღალი საქაროზა, ამონიუმის სულფატი, და gt0.1M TrisHCl, & gt1MNa აცეტატი ან Na ფოსფატი, EDTA, შემამცირებელი საშუალებები და ა.შ.


პრობლემა ამონიუმის სულფატის ნალექებთან - რა უნდა გავაკეთო? (2004 წლის 17 აპრილი/17 აპრილი)

იქნებ სცადოთ მარტივი გელი ფილტრაცია (ზომა) თქვენი ცილის გასაწმენდად.

მე ვმუშაობ მრავალ დომენის ცილაზე. ის არ არის მიბმული რაიმე მიდრეკილებაზე, იონ-გაცვლაზე ან ჰიდროფობიურ სვეტზე. ამიტომ ვცადე ამონიუმის სულფატი pptn. ნალექის შემდეგ ცილა ხდება უხსნადი და მე არ შემიძლია მისი ხელახლა შეჩერება ნებისმიერ ბუფერში და მისი ხსნადი. ეს ასე იყო თუნდაც 10-15% ამონიუმის სულფატის შემთხვევაში.
ასე რომ, მე გადავედი თუთიის სულფატზე ამონიუმის სულფატის ნაცვლად. ახლა მე ვიღებ ამ პროტეინს ხსნადი ფრაქციით მხოლოდ მაშინ, როდესაც მას ბევრს გავზავებ. როდესაც ვცდილობ ამის კონცენტრირება, ის კვლავ ილექება.
ახლა როდესაც ცილას ვდებ გელის ფილტრაციის სვეტზე, ის გამოდის ძალიან ახლო მოცულობასთან. და პლუს ეს ფრაქცია სულაც არ არის სუფთა.
შეუძლია თუ არა რომელიმე სხეულს შემოგთავაზოთ როგორ გაასუფთაოთ ეს ცილა?

ამონიუმის სულფატი უნდა დაიშალოს 4.1 მ -მდე, ამიტომ გამოხდილ წყალში 4 მ ხსნარი არ უნდა იყოს პრობლემა. ჩვეულებრივ, თქვენ იყენებთ გაჯერებულ ხსნარს თქვენი ცილის ხსნარში, ამონიუმის სულფატის პროცენტის მისაღებად (ანუ 1 ტომი გაჯერებული ამონიუმის სულფატი + 1 მოცულობის თქვენი ცილის ხსნარი -და gt 50% ამონიუმის სულფატის ნალექი)

მე ვცდილობდი მომემზადებინა 4 მ ამონიუმის სულფატის ხსნარი ჩემი ნალექისთვის. მე მას ვამატებ წყალს, მაგრამ ის არ დაიშლება სრულად მრავალსაათიანი აღრევის შემდეგ. ვინმეს შეუძლია დაგეხმაროს დეტალების მიწოდებაში, თუ როგორ უნდა მოვამზადოთ 4 მ ამონიუმის სულფატის ხსნარი?

ძვირფასო ყველა
მე წარმოებული ალფა ამილაზას ფერმენტის ერთად Bacillus licheniformis
მოცულობით 2 ლიტრი. ალფა ამილაზას აქტივობის ანალიზი გაკეთებულია და დარწმუნებული ვარ, რომ მას აქვს ამილაზას აქტივობა.
ახლა მსურს ჩემი ფერმენტის კონცენტრირება ამონიუმის სულფატის ნალექებით და შევადარო ის ულტრა ფილტრაციასთან, მაგრამ აქამდე გაკეთებულ სამ ანალიზში მე არ მაქვს რაიმე ნალექის მოპოვება გაჯერების 85% და ასევე ნებისმიერი პელეტი.
როგორც ვვარაუდობ, ჩემი ნიმუშის 10-2o მლდან უნდა მქონდეს მინიმუმ 1 მილილიტრი ნალექი, მაგრამ სამწუხაროდ მე არ მაქვს რაიმე ნალექი.
მე ძალიან ნერვიული ვარ, რადგან უნდა დავასრულო პრაქტიკული სამუშაო ორი თვის შემდეგ. რა უნდა გავაკეთო ამ პრობლემისთვის. რას მირჩევ ?
წინასწარ მადლობა

რა იცით თქვენი ცილის შესახებ? მაგალითად, იცით pI? შეგიძლიათ განათავსოთ თქვენი ლიზატი იონის გაცვლის სვეტზე? ეს საშუალებას მოგცემთ მოიცილოთ ბევრი სხვა ცილა და მოახდინოთ თქვენი ცილის კონცენტრირება.

რაც შეეხება აპარნას, გიცდიათ იონების გაცვლა & quotwrong & quot pH- ზე? გახსოვდეთ, რომ გამოთვლილი pI მხოლოდ თეორიულია. თქვენს პროტეინს შეიძლება ჰქონდეს დამუხტული ლაქები, რაც იმას ნიშნავს, რომ ის იმოქმედებს საწინააღმდეგოდ ინტუიციურად რასაც ამბობს ტექსტი და ციტატა. თქვენ ასევე შეგიძლიათ სცადოთ რბილი საპირისპირო ფაზის ქრომატოგრაფია.

მე ვმუშაობ მრავალ დომენის ცილაზე. ის არ არის მიბმული რაიმე მიდრეკილებაზე, იონ-გაცვლაზე ან ჰიდროფობიურ სვეტზე. ამიტომ ვცადე ამონიუმის სულფატი pptn. ნალექის შემდეგ ცილა ხდება უხსნადი და მე არ შემიძლია მისი ხელახლა შეჩერება ნებისმიერ ბუფერში და მისი ხსნადი. ეს ასე იყო თუნდაც 10-15% ამონიუმის სულფატის შემთხვევაში.
ასე რომ, მე გადავედი თუთიის სულფატზე ამონიუმის სულფატის ნაცვლად. ახლა მე ვიღებ ამ პროტეინს ხსნადი ფრაქციით მხოლოდ მაშინ, როდესაც მას ბევრს გავზავებ. როდესაც ვცდილობ ამის კონცენტრირება, ის კვლავ ილექება.
ახლა როდესაც ცილას ვდებ გელის ფილტრაციის სვეტზე, ის გამოდის ძალიან ახლო მოცულობასთან. და პლუს ეს ფრაქცია სულაც არ არის სუფთა.
შეუძლია თუ არა რომელიმე სხეულს შემოგთავაზოთ როგორ გაასუფთაოთ ეს ცილა?

გიცდიათ აცეტონის ნალექი? კარგად მუშაობდა ჩემთვის.

1. დაამატეთ 4 ტომი ყინულის ცივი აცეტონი
2. ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში ყინულზე ან -20 ° C ტემპერატურაზე
3. ცენტრიფუგა 10 წუთის განმავლობაში მაქსიმალური სიჩქარით სკამზე ცენტრიფუგაში. გადაყარეთ ზეწარი და ჰაერი გააშრეთ მარცვალი.
4. სურვილისამებრ: გარეცხეთ გრანული 100 მიკროლ ყინულოვანი ეთანოლით და გააშრეთ გრანული ჰაერში
5. ხელახლა გააჩერეთ მარცვალი ბუფერში შემდგომი გამოყენებისათვის.

kylvalda რა ბუფერი უნდა გამოვიყენოთ ბოლოსთვის, საბოლოო გრანულის ხელახლა გამოსაყენებლად შემდგომი გამოყენებისთვის? (აცეტონის ნალექებით, როგორც თქვენ შემოგვთავაზეთ), მადლობა.

მე უბრალოდ მინდა გკითხოთ, საიდან იცით, რომ ამონიუმის სულფატის ნალექი იმუშავებს ცილაზე, რომლის სიმძლავრეა 20 კვტ -ზე მეტი MW?
გაქვთ ლიტერატურა ამის შესახებ?
ეს დამეხმარება, რადგან ვმუშაობ ფერმენტზე, რომელსაც აქვს MW 5-10 კდ.ა.


Კითხვა: ამონიუმის სულფატის მიერ LDH გამწმენდის ცხრილის მონაცემების საფუძველზე ნალექის პასუხი კითხვა აქტივობა დაუმუშავებელი ექსტრაქტის კონცენტრაცია (უმოლ/წთ*მლ) მთლიანი აქტივობა (უმოლ/წთ) გულის ნედლეული 36 5600 40% პელეტი 120 2900 40% სუპერნატანი 13 1700 70% პლეტი 97 1500 70% Supernatant 1.5 200 მოსალოდნელია, რომ LDH გამოვა 70% ამონიუმის სულფატის მარცვლებში. რა

მოსალოდნელია, რომ LDH გამოვა 70% ამონიუმის სულფატის მარცვლებში. ყველა ფრაქცია (ზეპირი და მარცვლები) გაანალიზდება. • ფაქტობრივი წერტილი, სადაც LDH ილექება შეიძლება განსხვავდებოდეს ცილის კონცენტრაციისა და ტემპერატურის მიხედვით. ზოგიერთი ნაწილი გაყინული იქნება, მაგრამ არ გაყინოთ ნიმუშები ფერმენტული ანალიზისთვის: შეინახეთ 4 ° C ტემპერატურაზე. დიდი რაოდენობით LDH აქტივობის მქონე ფრაქციები გაერთიანდება და მოთავსდება დიალიზის ტომარაში ამონიუმის სულფატის ნალექის დასრულების შემდეგ.

აღადგინეთ თქვენი LDH აქტივობის უმრავლესობა მარილის მოსალოდნელ ჭრილში (70% გრანული)?

თუ ასეა, გამოიტანეთ ლოგიკური დასკვნა იმ შეცდომის შესახებ, რომელიც შესაძლოა დაუშვათ, თუკი თქვენი ცილა აღმოჩნდა 70% -იან ზებუნებრივ შემადგენლობაში.

თუ არა, სად იპოვეთ თქვენი LDH– ის უმეტესი ნაწილი და გამოიტანეთ ლოგიკური დასკვნა შეცდომის შესახებ, რომელიც შეიძლება დაუშვათ ექსპერიმენტის მსვლელობისას.


დისკუსია

ვაშლის ხილის უჯრედულ ექსტრაქტებში GAD აქტივობა რეგულირდება როგორც pH, ასევე Ca 2+ /CaM

GAD ფერმენტები ყველგან არის გავრცელებული ყველა სამეფოში და მცენარეებში ტრანსკრიპტების დაგროვება და აქტივობა შეიძლება გამოწვეული იყოს განვითარების დროს და აბიოტური და ბიოტიკური სტრესული დარღვევების საპასუხოდ [2, 4]. მცენარეებში, რომლებიც განიცდიან ტემპერატურის სტრესს, გვალვას, მარილიანობას ან მექანიკურ დამუშავებას, აღინიშნება უჯრედში Ca 2+ კონცენტრაციის ზრდა [19], რაც ხელს შეუწყობს GAD– ის სტიმულაციას Ca 2+ /CaM– ით, ხოლო მომატებული CO– ს ზემოქმედება2, ო2 დეფიციტი და ჭრილობა გავლენას მოახდენს GAD– ის მოქმედებაზე მრავალი მცენარის ქსოვილსა და სახეობაში ციტოზოლის მჟავიანობით [19, 20]. როგორც ნაჩვენებია GABA დაგროვება ვაშლის ნაყოფში კონტროლირებადი ატმოსფეროს შენახვის დროს და ეს დონე უფრო მაღალია მომატებული CO– ით ხანგრძლივი მკურნალობის დროს2[12-14], ჩვენ დავუშვით ჰიპოთეზა, რომ ვაშლის ნაყოფის GAD აქტივობა სტიმულირდება ციტოზოლის მჟავიანობით და /ან Ca 2+ /CaM. ვაშლის ხილის უჯრედული ექსტრაქტების GAD აქტივობამ გამოავლინა ოპტიმალური აქტივობა pH 5.5 PLP– ის და გლუტამატის გაჯერების თანდასწრებით (ცხრილი 1), საბოლოო სპეციფიკური აქტივობა შედარებულია ინ ვიტრო პეტუნიის, სოიოს მცენარეული ქსოვილების საქმიანობა, არაბიდოფსისი და ზღვის ფიჭვის ნერგები [1]. ვაშლის ნაყოფის GAD აქტივობა უფრო მკვეთრად იყო სტიმულირებული Ca 2+ /CaM– ით ფიზიოლოგიურ pH– ზე ვიდრე მჟავე pH– ზე (ცხრილი 1), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ის შეიძლება დარეგულირდეს პლანტაში Ca2+ /CaM და pH- ით. ვინაიდან არ იყო CaM ანატაგონისტის, TFP- ის ეფექტი ინ ვიტრო GAD საქმიანობა, ვარაუდობენ, რომ GAD არ იყო დაკავშირებული ენდოგენურ CaM– თან და Ca 2+ /CaM– ის GAD– თან შეკავშირება მკაცრად კონტროლდება სპეციფიკური კონტროლირებადი ატმოსფეროს სტრესის პარამეტრებით. საერთო ჯამში, ვაშლის ხილის უჯრედულ ექსტრაქტებში GAD აქტივობის ბიოქიმიური თვისებები ხელს უწყობს Ca 2+ /CaM რეგულირებადი GAD არსებობას, როგორც ეს მცენარეების უმეტესობისთვისაა დამახასიათებელი [1]. აღსანიშნავია, რომ სამი ჰომოლოგია GAD გენები (დამატებითი ფაილი 1: სურათი S1), დანიშნულია როგორც MdGAD1, MdGAD2 და MdGAD3, იმყოფებოდნენ ვაშლის ქარხანაში (სურათი 2). MdGAD1, მსგავსი AtGAD2, იყო უხვად და ყველგან, ვინაიდან MdGAD2 და MdGAD3, მსგავსი AtGAD3 და AtGAD4, გამოითქვა გაცილებით დაბალ დონეზე და შესაძლოა იყოს კანდიდატები ინდუქციისთვის ხილში სტრესებით (ანუ გაცივება, ო2 დეფიციტი და მომატებული CO2) დაწესებულია კონტროლირებადი ატმოსფეროს შენახვის დროს (სურათი 2) [2, 3].

ვაშლის ხილის რეკომბინანტი GADs იყო როგორც CaM- დამოკიდებული, ასევე CaM- დამოუკიდებელი

მარკირების/გამწმენდის სტრატეგიებით, ჩვენ შევძელით დავამტკიცოთ ეს რეკომბინანტი ზეGAD1 გააქტიურებულია ფიზიოლოგიურ pH- ზე Ca 2+ /CaM- ით, შენარჩუნებულია თუ არა 6-His ნიშანი აქტივობისა და სპექტრალური თვისებების ანალიზის დროს (სურათი 3 და 4). თუმცა, გააქტიურების ხარისხი ყველაზე დიდი გამოჩნდა მშობლიური ცილის რეკომბინანტული ფორმით, რაც შეიძლება მიეკუთვნებოდეს ძალიან დაბალ აქტივობას, რომელიც ნაპოვნია Ca 2+ /CaM არარსებობისას. მიუხედავად იმისა, რომ ეს ინტერპრეტაცია გარკვეულწილად ართულებს მცირე ზომის დამაბინძურებელი ცილის ცვალებად რაოდენობას, ალბათ დეგრადაციის პროდუქტს, ცილის საბოლოო მომზადებისას, ეს დასკვნები მეტყველებს იმაზე, რომ Ca 2+ /CaM- ის გავლენის ინტერპრეტაცია tagged- ის კონფორმირებასა და ბიოლოგიურ აქტივობაზე. მცენარეების რეკომბინანტი GADs უნდა გაკეთდეს სიფრთხილით [11].

აქ გამოხატული იყო სამი ვაშლის GAD- ის მისი წარწერები ან დაუნიშნავი ვერსიები ეშერიხია კოლი და გაწმენდილია ერთგვაროვნებამდე ან თითქმის ერთგვაროვნებამდე (დამატებითი ფაილი 2: სურათი S2). პროგნოზირებული ქვედანაყოფი ვაშლის სამი რეკომბინანტული ცილებიდან (56.6-57 კდ.ა) მსგავსია მცენარეული GAD– ების უმრავლესობისა, რომლებიც არსებობს 43–62 კდ ა ქვედანაყოფების ჰექსამერებად [1]. ვაშლის რეკომბინანტმა GAD– ებმა აჩვენეს იგივე pH პროფილი, როგორც ეს ნაჩვენებია ვაშლის ხილის უჯრედულ ექსტრაქტებში GAD– ის აქტივობისას (ცხრილი 1, სურათი 3), ისევე როგორც მსგავსი pH ოპტიმალური მცენარეული GAD– ების უმრავლესობასთან და Ca 2 აქტივობებთან ერთად. + /CaM ფიზიოლოგიურ pH- ზე, რაც უფრო მაღალია ან აღემატება მათ მაქსიმალურ აქტივობას ლიტერატურაში [1]. მცენარეული GAD– ების უმეტესობისგან განსხვავებით, ქალბატონიGAD3 არ იყო გააქტიურებული Ca 2+ /CaM– ით ფიზიოლოგიურ pH– ზე, მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევაში გამოყენებულმა ტექნიკამ /ანალიზმა ნათლად შეძლო ასეთი ურთიერთობის დემონსტრირება (ცხრილი 1, ფიგურები 3 და 4). ისტორიულად, CaM– ის შენახვა C– ტერმინალურ დომენში საჭიროდ იქნა მიჩნეული GAD– ის ავტოინჰიბირების შესამსუბუქებლად ფიზიოლოგიურ pH– ზე [1]. თუმცა, ოსGAD2 (სურათი 1) აღმოჩნდა CaM- დამოუკიდებელი და გააჩნდა C ტერმინალის რეგიონი, რომელიც არის ავტოინჰიბიტორული [5]. ქალბატონიGAD3 არის მხოლოდ მეორე მოხსენებული მცენარე GAD, რომელიც არ შეიძლება გაიწმინდოს CaM- მიდრეკილების ქრომატოგრაფიით და რომლის აქტივობასა და სპექტრულ თვისებებზე გავლენას არ ახდენს Ca 2+ /CaM. აღსანიშნავია, ქალბატონიGAD3 არის პირველი ქარხანა GAD, რომელსაც გააჩნია C ტერმინალის რეგიონი, რომელიც არ არის ავტოინჰიბიტორული (სურათი 3).

C- ტერმინალური რეგიონის განლაგება ქალბატონიGAD1 და ქალბატონიGAD2 ბიოქიმიურად დახასიათებული მცენარეული GAD– ით აჩვენა, რომ CaMBD ძირითადი ნარჩენები დაცულია ვაშლის ფერმენტებში და რომ ისინი არ არსებობს ოსGAD2 (სურათი 1). კარგად შემონახული ტრიპტოფანი და წყვილი ლიზინის ნარჩენები C- ტერმინალის ბოლოს გადამწყვეტია CaM– სთან ურთიერთქმედებისათვის და მაღალი მოლეკულური წონის ოლიგომერების წარმოქმნისათვის დოქტორიGAD და ზეGAD1 [9, 16, 21, 22]. მცენარეული GAD– ების შედარებით, რომლებიც ცნობილია სტიმულირებული Ca 2+ /CaM– ით, ქალბატონიGAD3– ს აკლია ორი დადებითად დამუხტული გვერდითი რეგიონი (Lys474-Lys475 და Lys496-Lys497) და Trp488-Lys489-Lys490-Phe491-Tyr492 მოტივი (სურათი 1). მათი არაკონსერვაციული ნარჩენებით ჩანაცვლება შეიძლება აიხსნას რეკომბინანტის Ca 2+ /CaM სტიმულაციის ნაკლებობა ქალბატონიGAD3. საინტერესოა, რომ თითქმის ყველა CaM- სავალდებულო ნარჩენები მცენარეთა GAD– ში შენარჩუნებულია ქალბატონიGAD1 და ქალბატონიGAD2 ძირითადი გამონაკლისები, რომლებშიც საფასური არ არის დაცული არის შემცვლელები Lys474 და Lys 490 in ქალბატონიGAD1 და Lys497 in ქალბატონიGAD2 (სურათი 1).


J64419 ამონიუმის სულფატი, ულტრა სუფთა, 99+%

ამონიუმის სულფატი ფართოდ გამოიყენება რეაგენტი მოლეკულურ ბიოლოგიასა და ქრომატოგრაფიაში. ის სასარგებლოა ფერმენტებისა და ცილების გამოყოფისა და გაწმენდისას. იგი გამოიყენება ცილების ნალექის ან ფრაქციისათვის ან ანტისხეულების გასაწმენდად. ის ასევე სასარგებლოა ნუკლეინის მჟავებისა და ცილების კრისტალოგრაფიული ანალიზისათვის. ამონიუმის სულფატი ასევე ფართოდ გამოიყენება ცილების HPLC– ში, როგორიცაა ჰიდროფობიური ურთიერთქმედების ქრომატოგრაფიაში. ამონიუმის სულფატი გამოიყენება ხანგრძლივი PCR ბუფერში, PCR ლიზის ხსნარში და cDNA მეორე სინთეზის სინთეზში. ასევე გამოიყენება ფოსფოლიპიდების HPLC ანალიზისთვის.

Примечания

Ссылки на литературу

გილად ხარანი. რივკა კოენი. ლილიანა კ ბარი. ეჩეზკელ ბარენჰოლცი. ლიმოსომებში ამონიუმის სულფატის ტრანსმემბრანული გრადიენტები წარმოქმნის ამფიპათიური სუსტი ფუძეების ეფექტურ და სტაბილურ ჩახშობას. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - ბიომემბრანები. 1993, 1151 (2), 201-215.

ტაჯი ასტრუპი. სტენ მიულერცი. ფიბრინის ფირფიტის მეთოდი ფიბრინოლიზური აქტივობის შესაფასებლად. ბიოქიმიისა და ბიოფიზიკის არქივი. 1952, 40 (2), 346-351.

Фразы опасности и предосторожности СГС

Фразы опасности (ЕС): H303

გადაყლაპვის შემთხვევაში შეიძლება საზიანო იყოს.

ფრაზების პრედოსტოროგენისტი: P270-P301+P312-P403-P501c

არ ჭამოთ, დალიოთ ან მოწიოთ ეს პროდუქტი. გადაყლაპვის შემთხვევაში: დარეკეთ შხამების ცენტრში ან ექიმთან/ექიმთან, თუ თავს ცუდად გრძნობთ. შეინახეთ კარგად ვენტილირებადი ადგილას. გადაყარეთ შინაარსი/ კონტეინერი ნებადართული ნარჩენების განთავსების ქარხანაში


დისკუსია

ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ III ტიპის ინტერფერონებს (IFN) აქვთ მსგავსი ბიოლოგიური აქტივობები I ტიპის IFN– ებთან. IFN-λ- ს შეუძლია შეაფერხოს B ჰეპატიტის რეპლიკაცია ადამიანის უჯრედებში [13] და მსგავსი ეფექტი აქვს IFN-α– ს C ჰეპატიტის ვირუსით დაავადებულ პაციენტებში [14]. III ტიპის IFN– ს შეუძლია დათრგუნოს მრავალი სხვა სახის ვირუსი, მათ შორის ჰერპეს მარტივი ვირუსის (HSV) [15] და ციტომეგალოვირუსი (CMV) [16], I ტიპის IFN– ის მსგავსად. III ტიპის IFN ასევე მონაწილეობს შეძენილ იმუნურ პასუხში [17] და შეუძლია შეაფერხოს კიბოს უჯრედები კლინიკური გამოყენების პოტენციალით [15].

IFN-λR1, რომელიც არის III ტიპის IFN, რომელიც მკაცრად არის გამოხატული ეპითელური უჯრედების გარკვეული ტიპებით და იმუნური უჯრედების სპეციფიური ქვეჯგუფებით, აქვს განსხვავებული რეცეპტორული ქვეგანყოფილება IFN ტიპის I კოლეგებთან [18]. ეს ნიშნავს, რომ IFN-λ თერაპიამ შეიძლება გამოიწვიოს ნაკლები გვერდითი მოვლენები ვიდრე IFN-α თერაპიამ, რაც ჩვეულებრივ იწვევს აუტანელ გვერდით ეფექტებს. HCV თერაპიის კვლევამ აჩვენა, რომ პეგილირებული IFN-λ1 ფლობდა ანალოგიურ ანტივირუსულ მოქმედებას პეგილირებულ IFN-α2b– სთან, მაგრამ ნაკლები გვერდითი ეფექტებით [19]. გარდა ამისა, IFN-λ რეცეპტორის ქსოვილებით შეზღუდული გამოხატვის მახასიათებელი IFN-λ1 არის პერსპექტიული კანდიდატი კლინიკური გამოყენებისთვის, განსაკუთრებით სასუნთქ, კუჭ-ნაწლავის და რეპროდუქციული ტრაქტის ეპითელური ქსოვილის ზოგიერთი დაავადებისათვის. მაგალითად, არსებობს მტკიცებულება, რომ III ტიპის IFN სისტემა მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ასთმის მკურნალობაში [20].

CHO უჯრედებში ჩვენი გამოხატვის სისტემა გამოხატავდა rhIFN-λ1 სტაბილურად და განუწყვეტლივ. Flp-In-CHO უჯრედები შეიცავს იმავე ქრომოსომულ FRT ადგილს, როგორც ვექტორი, ასე რომ, როდესაც რეკომბინანტი pDF-IFN-λ1 და დამხმარე პლაზმიდი pOG44 თანადაფინანსებულია Flp-In-CHO უჯრედებში, pOG44 კოდირებით დაშიფრული flp რეკომბინაზა შეიძლება იყოს ჰომოლოგის შუამავლობა. ეგზოგენურ გენსა და მასპინძელ დნმ -ს შორის რეკომბინაცია, რაც იწვევს სტაბილურ გამოხატვას. აქ, ამონიუმის სულფატის ნალექი და სამი ქრომატოგრაფიული ნაბიჯი იქნა გამოყენებული სამიზნე ცილის გასაწმენდად, რადგან rhIFN-λ1 არ იყო შერწყმული ტეგთან გამწმენდისთვის. ეს იმიტომ ხდება, რომ კლინიკური გამოყენების რეკომბინანტული ცილოვანი პრეპარატები არ უნდა შეიცავდეს ნიშანს. გაწმენდილი ცილა გააჩნდა მაღალი ანტივირუსული მოქმედება. გარდა ამისა, CHO ექსპრესიული სისტემა უზრუნველყოფს ანალოგიურ პოსტტრანსლაციულ გლიკოზილირებას, რაც ადამიანის ენდოგენურ ცილაზე გვხვდება [21]. ეს შედეგები საფუძვლად უდევს rhIFN-λ1– ის შემუშავებას, რომლის კლინიკური გამოყენებაც შესაძლებელია.